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禽传染性支气管炎病毒S1基因RT-PCR、RT-套式PCR扩增及其序列分析

魏勇

  本研究采用RT-PCR(reverse translation-polymerase chain reaction)和RT-套式PCR(reverse translation-nest polymerase chain reaction)对7株禽传染性支气管炎病毒(IBV:M_(41)、Ma_5、SAIB_4、SAIB_(14)、SAIB_(WJ)、SAIB_6、SAIB_9)进行了S1基因的扩增,首次对四川地区分离的3株IBV的S1基因进行了序列分析。本研究利用SDS-蛋白酶K法提取7株IBV的基因组RNA。根据国际基因库Genbank注册的IBV呼吸型标准毒株(M_(41)株)的S糖蛋白基因全序列设计了内、外两对引物。用外引物对7株IBV的S1基因进行了RT-PCR扩增,其中M_(41)、Ma_5、SAIB_4、SAIB_(14)、SAIB_(WJ)5株获得了长约1.72kb特异条带,SAIB_6、SAIB_9 2株未扩增出特异条带。7株IBV的RT-PCR扩增产物经稀释后用内引物进行RT-套式PCR扩增,7株都得到长约1.62kb的特异扩增条带,结果表明RT-套式PCR扩增较RT-PCR具有更高的敏感性。将SAIB_4、SAIB_(14)、SAIB_(WJ)三株IBVS1基因的RT-PCR特异扩增条带插入到pUC18质粒多克隆位点,转化DH_(5α)载体菌,筛选获得阳性克隆菌株。对克隆质粒中外源片段序列测定表明,所测序列内均含有长为1611bp的IBV S1结构基因,编码537个氨基酸,N-端有一编码18个氨基酸的信号肽序列。本研究首次将3株四川分离株SAIB_4、SAIB_(14)、SAIB_(WJ)的S1基因在国际基因库Genbank注册(注册号:SAIB_4为bankit404421、SAIB_(14)为bankit404417、SAIB_(WJ)为bankit404422)。与国际基因库Genbank注册的IBV M_(41)标准株S1基因序列比较,SAIB_(14)、SAIB_4、SAIB_(WJ)的S1基因与其核苷酸序列同源率分别为95.10%、79.24%、80.45%,相应的氨基酸序列同源率分别为91.44%、75.61%、76.16%。本研究丰富了IBV分子流行病学资料,为进一步研制IB DNA疫苗提供了基础材料。……   
[关键词]:IBV;S1基因;RT-PCR;RT-套式PCR;克隆;序列分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2001年