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烟草花叶病毒弱毒疫苗的研制及其分子生物学

邵碧英

  烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的代表种,给许多种植物造成严重损失。福建农林大学植物病毒研究所对福建烟草病毒种群和田间发生频率的调查研究表明,TMV在福建几个主要烟区占有很高的比例,其中以TMV普通株系为优势株系。利用病毒的弱毒株的交互保护作用是防治病毒病较为理想的手段之一。为此本文对TMV弱毒株的获得方法、生物学特性、分子生物学方面进行了较系统的研究。从福建烟区分离、纯化、鉴定到TMV普通株系。通过高温处理、亚硝酸诱变及两者的复合处理对强毒株TMV-W进行诱变,筛选获得了两个弱毒株,记为TMV-017(高温处理)、TMV-152(复合处理)。应用正交设计法考察病毒接种浓度、接种间隔时间、接种部位以及普通烟生育期等因素对弱毒株交互保护作用的影响,结果表明烟苗生育期和接种间隔时间两个因素影响最大。弱毒株接种12d后才有较好的保护作用。浸根法可适用于弱毒株的大量接种。考察了弱毒株本身对烟草植株的影响。在普通烟上分别接种TMV-W、TMV-017、TMV-152,考察3者在接种叶上的病毒的增殖情况以及叶绿素a、叶绿素b、叶绿素、可溶性蛋白含量的变化。结果表明弱毒株的增殖速率、在烟草植株体内的稳定浓度低于强毒株。分别受强、弱毒株侵染的烟草叶片中的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素含量均有所下降,但强毒株引起的下降幅度最大。可溶性蛋白含量变化幅度不太明显。观察了分别受TMV-W、TMV-017侵染的烟叶细胞病理的变化。健康烟叶的叶绿体具双层膜,基粒片层紧密整齐,内含大量淀粉粒。受TMV-017侵染的烟草细胞中,叶绿体数量较少,叶绿体具双层膜结构,基粒片层排列整齐,有的叶绿体膨大,内含少量小的淀粉粒。叶绿体周围经常出现4-6个线粒体。细胞质中出现结晶状内含体,经常存在于叶绿体周围。受TMV-W浸染的烟草细胞中,有的叶绿体破裂,基粒松散。细胞质中的线粒体增多,增大,有的形状不规则。细胞质中也出现晶体状内含体,分布在叶绿体周围。测定了TMV-W、TMV-017、TMV-152的基因组cDNA全序列(GenBank福建农林大学博士学位论文*接收号分别为:AF395127、AF395128、AF395129X 结果表明,强、弱毒株基因组均为6395个核昔酸,具有4个开放阅读框(ORF),分别编码126kDa蛋白(69-3419nt,ill6ed和183kDa通读蛋白(69-4919nt,1616eq、运动蛋白(4903-5709m,268盼)、外壳蛋白(5712-619Im,159eq。5’端非编码区爬)为68nt*,通读蛋白和运动蛋白基因有17个碱基重叠,运动蛋白和外壳蛋白基因间隔区为Znt(5710-57lint),3’端NR区为204nt(6192-6395nt)。TMV-W和TMV-UI相比,基因组同源率达到98%,TMV.W为普通株系。TMV,of 7、TMV.152基因组核苦酸发生变异的部位主要在126/183kDa蛋白ORF。和TMV.W相比,TMV.of 7仅在126kDa蛋白ORF中有18个碱基发生变异,m个引起氨基酸的变异;而TMVJ 在126门83kD蛋白OM中有16个碱基发生变异,其中有11个引起氨基酸的变异。TMV.of 7和TMV.152有11个共同变异的碱基,其中8个引起氨基酸的变异。TMV-152在 MPOny中有1个碱基引起氨基酸的变异。其它区域,三者完全相同。首次尝试将弱毒株的缺失复制酶基因转化烟草。构建了含TMV.W、TMV-of 7各2个126kDa蛋白O肚的部分片段,EIEZ(873-2813nt)、RI EZ的928 3nt)的植物表达载体。经农杆菌Ti质粒介导转化烟草。再生植株总DNA的Southern点杂交检测结果初步表明,一个片段均己整合到烟草基因组中。再生植株总RNA的RT-PCR Southern点杂交检测结果初步表明,4个片段均有转录。用含TMV-W EIEZ的重组克隆和载体pGEX上,构建了重组原核表达载体,诱导表达出融合蛋白O4kDal,制备了抗血清。免疫斑点杂交检测抗血清的适宜工作浓度为1:100。转化植株能延迟、减轻攻击病毒oMV-W)的症状表现,含TMV-WEI EZ片段的转化植株中有1株抗性水平高。……   
[关键词]:烟草花叶病毒;弱毒株;交互保护作用;基因组RNA;序列分析;致弱机理;抗病毒植物基因工程
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2001年