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Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒转染DCs及特异性CTL的体外诱导

谢芳艺

  本文旨在通过EB病毒LMP2A重组痘苗病毒转染的DCs体外诱导LMP2A特异性CTL。EB病毒是一种普遍存在的人类γ-疱疹病毒。现已证实,它与多种恶性疾病如鼻咽癌、Burkitt s淋巴瘤、大约50%的何杰金氏病以及免疫妥协病人的淋巴增生性疾病等有关联。鼻咽癌是我国广东、广西、香港及江苏沿海地区的高发肿瘤,不能采用手术切除,而化疗、放疗后不能有效清除肿瘤细胞,绝大多数病人复发。因此,进行鼻咽癌其它治疗手段的研究非常重要。近年来,树突状细胞(DC)由于具有最强的抗原递呈功能而成为研究的热点。DC可强有力地激活T细胞,有“天然免疫佐剂”之称。近年来,应用细胞因子体外诱生DC成功,满足了实验和临床应用的需要。通过GM-CSF、IL-4和TNF-α培养体系,我们诱导出了人外周血单核细胞来源的DC。同时,我们选用了在鼻咽癌患者中表达的EB病毒潜伏蛋白之一LMP2A作为靶基因,利用痘苗病毒这一载体,转染诱导的DC。随后,用紫外线照射转染的DCs灭活重组痘苗病毒。经此处理的DCs与自体PBMCs混合培养,在IL-2的刺激作用下获得特异性CTL。实验结果概述如下:1.人外周血单核细胞经GM-CSF、IL-4、TNF-α的混合培养,10天可获得成熟的功能性DCs。FACS检测显示DC表面相对特异性标志CD83高表达(94.2%),MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子及共刺激分子都高表达,分别为HLA-ABC(98.3%)、HLA-DR(96%),CD40(97.7%)、CD80(98.2%)。MLR结果显示此法诱导的DC有京巨抖大学硕士学位论文具有强烈地激发初始型T细胞增殖的能力。2.重组痘苗病毒可有效地将目的基因EBV工导入DCS,经间接免疫荧光法及FACS检测表明转染的最佳条件为MOI叫,时间12小时。另外,根据台盼蓝染色计数及照射上清接种CVI的结果综合分析,紫外线照射门0瓦特、35cm)能灭活重组痘苗病毒,而对DC无损伤,最佳照射时间为30分钟。3.经照射处理的DCS与自体 PBMCSvXI:20的比例混合培养,于培养第 4天加入 IL上,50U阿。于培养第 8天以同样比例加入转染并处理的DCS。培养过程中,每4天半量换液一次。培养第15天收获诱导细胞,采用LDH释放法检测CTL特异性杀伤活性,平均达34.3%。我们的结果表明,重组痘苗病毒能有效地将目的基因*B病毒LMPZA导入m,经过皿的加L、处理后,有效提呈给CD81细胞,并最终体外诱导出特异性CTL。本试验证实经过DC的有效递呈,EB病毒免疫原性较弱的潜伏蛋白能激发出有效的特异性CTL,为临床治疗鼻咽癌等EB病毒相关性疾病提供了实验和理论基础。……   
[关键词]:Epstein-Barr病毒;潜伏膜蛋白2A;重组痘苗病毒载体;树突状细胞;细胞因子;细胞毒性T细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京医科大学2001年