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副溶血性弧菌溶血毒素基因的克隆与表达研究

苏建新

  副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)为一种嗜盐性弧菌,能导致人类食物中毒和旅游者腹泻,还能导致反应性关节炎、心脏疾病等。以往临床上检测到的致病菌大多具有溶血现象(亦称神奈川现象,KP~+),基因水平研究发现该类病原体都携带tdh基因,编码TDH。近年的研究发现神奈川试验阴性株也可致病,并有逐年增加的趋势,基因水平研究发现其致病是由trh基因编码的TRH引起。TDH与TRH已被公认为Vp的主要致病因子,以往对TDH研究较多且较深入,而TRH在副溶血弧菌的致病中起着越来越重要的作用,但对其致泻和溶血的机制、毒素的功能结构域等尚不十分清楚。本研究应用基因工程技术克隆了trh、tdh基因,并实现在原核融合表达载体pGEX-3X上经IPTG诱导得到高效表达,并获得纯化蛋白。同时制备了抗-TRH兔血清,期望为下一步研究奠定基础。设计一对引物,采用PCR技术扩增trh基因,用限制性内切酶消化trh和pGEX-3X,连接并转化宿主菌DH5α,筛选并鉴定出重组质粒trh/pGEX-3X,由博亚生物技术有限公司完成序列测定。再转化至宿主菌DE3,发酵重组菌trh/pGEX-3X/DE3,条件优化后,trh在pGEX-3X上经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明,trh基因可得到高效、可溶、融合性表达;表达产物经谷光甘肽转硫酶(GST)Sepharose 4B亲和层析得到纯化的融合表达蛋白,该融合蛋白经因子Xa酶切并再次经GST亲和层析后即得到纯化的TRH。以纯化的TRH为抗原,背部皮下注射免疫大白兔,免疫程序为第1、第4、第5周,注射剂量分别为0.5mg/kg体重、0.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重。末次免疫后第7天试血,效果满意后放血。兔血清经宿主菌DE3吸附,溶血抑制试验提示兔血清含有抑制Vp溶血活性的物质。用同样的方法构建了tdh/pGEX-3X并经鉴定后转化、诱导表达,TDH的表达与预期不同,呈高效、不可溶、融合性表达而存在于包涵体中,无法经GST-Sepharose 4B亲和层析得到大量纯化蛋白。对包涵体进行裂解、复性,最后用快速蛋白液相层析吓PLC)的方法进行分离和纯化,得到纯化的GST-TDH融合蛋白。……   
[关键词]:副溶血弧菌;直接溶血毒素;溶血相关毒素;克隆;表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第一军医大学2001年
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