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两种虫草无性型原生质体融合及蜂头虫草发酵条件的研究

陈晓琳

  本文对古尼虫草小孢变种的无性型古尼拟青霉小孢变种蛋氨酸缺陷型(G106M)和蜂头虫草的无性型蜂头层束梗孢(HS01)的原生质体形成、再生条件和融合以及蜂头层束梗孢的发酵条件进行了研究。主要内容包括:G106营养缺陷型的筛选;G106M和HS01原生质体形成和再生最佳条件的确定;原生质体的融合;HS01发酵条件的确定。G106孢子悬浮液经紫外线处理90s后,培养12hr,滤除发芽的菌丝体,再培养、过滤后,滤液用紫外线处理20s,可使突变率增加4倍。对其中两株生长较好的突变株进行鉴定,结果为蛋氨酸缺陷型(G106M)和亮氨酸缺陷型(G106L)。稳定性检验结果表明这两株缺陷型均可作为原生质体融合时具有遗传标记的融合亲本。酶解试验结果显示:G106M采用1%溶壁酶与1%蜗牛酶混合液作为脱壁酶,0.6M的氯化钠为渗透压稳定剂,从摇床培养的16hr菌龄的菌丝体,酶解1.5~2hrs后,产量可达3.74×1O~7/ml。HS01采用3%溶壁酶作为脱壁酶,培养48hr菌龄的菌丝体,酶解3.5hrs后,原生质体产量可达2.5×10~7/ml。再生试验结果表明:G106M以培养12hr菌龄的原生质体在0.6M氯化钠的SDAY培养基上再生率最高,为17.92%;HS01以48hr菌龄的原生质体在添加 0.6M硫酸镁的黄豆粉培养基上再生率最高,为0.4%;两个菌株原生质体液体再生率都高于固体再生率,分别达31.245%和19%。用助融剂PEG进行原生质体融合的结果表明这两个不同种的菌株之间没有发生两套基因组间的接触和交换,从而没有发生基因的遗传重组,实现基因杂交;它们之间可能存在着核质之间的不相容性或者营养不亲和性。通过对原生质体形成过程的观察发现,GI 06M原生质体形成有三种形式,一种是菌丝顶端先膨大,然后释放出原生质体,二是从菌丝的亚顶端或中部的侧壁形成;三是菌丝原位释放出原生质体。而HS01 的原生质体形成只观察到两种方式,即顶端释放和原位释放。原生质体的再生方式有两种,一种是原生质体直接萌发长出芽管,然后形成菌丝体,另一种是原生质体形成酵母状物,然后形成菌丝。在原生质体再生形态观察时发现,凡是没有再生的原生质体往往是单个分散的,凡是密集在一起的原生质体,其再生都比较整齐。在供试的7种碳源和7种氮源中,HS01对白砂糖和黄豆粉的利用最好。进一步的正交试验确定了最佳培养基组成为:白砂糖3%,黄豆粉3%,复合维生素B31.4mg几。非营养性因子中研究了起始pH、装液量和接种时菌体形态。结果表明最佳条件为:起始pH为 6.8,适宜装液量为 60ml/250ml三角瓶,接种菌体形态为被高度分散的菌球。HS01 放大培养结果显示:该菌不太适宜在机械搅拌罐中进行深层发酵。在7升气升式发酵罐进行深层发酵,能使发酵周期大为缩短,可在144b出罐,干菌丝收获量为28.兆会‘Lc本文还对发酵过程中的pH、还原糖及总氮量的变化进行了研究。成分分析试验结果表明:HS01菌丝体中氨基酸种类和冬虫夏草生药一致,但氨基酸总量和人体所必需氨基酸总量明显高于冬虫夏草生药。……   
[关键词]:古尼虫草小孢变种;蜂头虫草;无性型;营养缺陷型;原 生质体融合;深层发酵
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽农业大学2001年
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