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DDR2在类风湿性关节炎滑膜细胞侵蚀软骨中的作用研究

王吉村

  关节滑膜组织的过度增生和对软骨的侵蚀是类风湿性关节炎(RA)关节软骨破坏和关节畸形的直接原因。为探讨滑膜组织过度增生和侵蚀软骨的机理,我们将类风湿性关节炎患者滑膜组织中成纤维样滑膜细胞(以下称滑膜细胞)进行体外培养和实验,研究RA滑膜细胞过度增殖和具有侵蚀性的细胞内机制。由于大多数蛋白酪氨酸激酶在细胞增殖和凋亡中是重要的信号分子,所以我们选择滑膜细胞内的蛋白酪氨酸激酶作为研究的出发点。首先根据己知的蛋白酪氨酸激酶保守区设计简并引物,克隆滑膜细胞内的蛋白酪氨酸激酶mRNA的3 部分。通过序列测定和分析,发现滑膜细胞至少表达六种蛋白酪氨酸激酶,分别为血小板衍生生长因子受体A(PDGFRA)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)、Janus激酶1(JAK1)、TYK2、盘状结构域受体激酶(DDR2)和Lyn。RNA点杂交分析表明,PDGFRA、IGF-1R和DDR2在RA滑膜细胞中的表达水平高于骨性第四 军医大学博士论文关节炎(OA,用作对照)滑膜细胞,其它三种激酶的水平在两种细胞中未见差异。DDRS是一类广泛分布的受体型酪氨酸激酶。目前研究认为,它们可能与细胞分泌MMP-l、神经组织和腺体的发育、肿瘤细胞的转移及细胞增殖相关。它们分两型,分别是DDRI和DDRZ。令人感兴趣的是,DDRs的配体是胶原,胶原对DDRZ的激活可使细胞高表达基质金属蛋白酶.1(MMP.l)。那么DDRZ是否在 RA关节病变中也。是重要的MMP-l的介导因索呢?同时,11型胶原在RA发病中一直受到关注,但确切机制尚不清楚。那么,11型胶原是否通过DDRZ而成为MMP-!的重要诱导因素呢?沿着这条思路,我们对DDRZ在RA滑膜细胞病变中的作用做了进一步的研究。由于OA细胞来源不足,后续的很多_厂作是采用 NIH 3T3细胞进行的。首先利用原位杂交技术和免疫组化技术观察了DDRZ在人膝关竹滑膜组织中的分布。发现不仅滑膜细胞层表达DDRZ,滑膜下层很多细胞也表达DDRZ,但细胞型别辨别不消;培养的RA滑膜细胞表达DDRZ,DDRZ主要分布干胞膜和胞浆。免疫印迹(Western blotting)显示,RA滑膜细胞和 NIH 3T3细胞均表达 DDRZ,但只有 RA滑膜细胞中的DDRZM活化的,NIH 3T3细胞中的DDRZ处于非活化状态。明胶酶谱分忻显示,RA滑膜细胞培养上清中可检测到较高水平的 MMPI活性,而NIH 3T3细胞和 OA滑膜细胞培养上清中均未检测到 MMP.1活性。11刑胜原刺激NIH 3T3细胞后,N!H 3T3细胞培养上淌中可检测到低水平的 MMP-!,同时细胞内 DDRZ被活化。这提示,RA滑膜细胞过分泌的MMP.l可能与其DDRZ处于活化状态相大;!!型肢原可以诱导NIH 3T3细胞分泌MMP.l,同时诱导DDRZ活化,此时MMP-1的分泌可能由DDAI介导。为了进一步确实DDRZ在RA滑膜细胞过分泌MMPI 中的介导作用,必须使用特异性DDRZ阻断剂。在没有商品化的小分子阻断剂的倩况下,我们尝试着表达了DDRZ受体胞外区。我们选择了DDRZ胞外区的两个片段进行克隆表达,分别称DA片段和DB片段,他们分别相应于DDRZ分于氨基端第23个氨基酸残基到第194个氨基酸残基和第23个氨基酸残基到第293个氨基酸残基,不包含信号肽序列。通过RT.PCR方法将两片段从人肺癌组织中扩增出,并分别克隆入T载体,测序鉴定后分别亚克隆到吓EX4T-l载体和pIG载体中。分别将pGEX-4T-IDA和的EX4T十DB片段在大肠杆菌中进行表达。发现均有表达,用谷眯甘肽亲和珠纯化可溶性部分,得到纯度达85%以上的目的蛋白(GST.DA和 GST-DB)。竞争结合抑制实验表明,GST-DB融合蛋白有阻断M型胶原与 DDRZ受Dgan"le’’t ofBtochen’ISYrr a,ld Moleer’lar Biblbel).4.第四军医大学博士论文体结合的功能。将GST-DB加到有*型胶原刺激的培养细胞中发现,RA滑膜细胞分泌MMP-l减少,胶原刺激下的NIH 3T3细胞分泌MMPI也有减少。这进一步提示,DDRZ介导*型胶原刺激下的NIH 3T3细胞和RA滑膜细胞分泌MMP-Ill型胶原对滑膜细胞的这种诱导作用在M关节软骨破坏中可能具有重要意义。。pIG载体是一种真核载体,它可使表达的目的蛋白在梭基端带上一个FC片段,FC段的融合可使……   
[关键词]:类风湿性关节炎;滑膜细胞;盘状结构域受体2;基质金属蛋白酶1;Ⅱ型胶原;软骨
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2001年