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幽门螺杆菌空泡毒素基因分段克隆、表达和活性研究

江红

  幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称Hp)是定植于人胃部的一种革兰氏阴性菌,它与慢性胃炎、消化性溃疡、粘膜相关淋巴样组织性淋巴瘤、胃癌等疾病的发生密切相关,它的感染率高,并且因为人免疫系统无法根除而长期生存于人的胃部。空泡毒素基因的表达产物—VacA(vacuolating cytotoxin A)是Hp所特有的分泌性毒素,是Hp的重要毒力因子,在体外,它能使哺乳动物上皮细胞发生空泡样变化,最终导致细胞死亡,它与Hp感染者的发病与否相关。在本研究工作中,我们首先对vacA基因进行分段克隆、表达。根据菌种CCUG 17874的VacA基因序列设计六对引物,以Hp菌株NCTC11638的总DNA为模板,扩增出vacA基因A、B、C、D、E和F六个片段,测序证实与文献报道的完全一致,将它们分别克隆入融合表达载体pRSETA,构建重组融合表达载体pRSET-vacA,转化大肠杆菌第四军医大学博士学位论文SL刀*臼O…a,经IP*G诱导,表达了五个氨基端融合* 的*。A片段田、C、D、E和F卜光密度扫描结果表明,融合蛋白分别占菌体总蛋白的47.8%、31.8%、43.6%、43.2%和22.7%,表达产物的相对分子量分别为33000、20240、26300、27500和32450,均以包涵体形式存在。在smol/L $存在条件下,His。B和His。-D的包涵体溶解,利用HIS。与过渡金属离子 Ni》高亲和力结合的性质,用 Ni\ NTA亲和树脂一步法纯化,获得纯度分别为98%和92%的*、E和*-D。他幻e—hi。t实验表明,所表达的融合蛋白能识别抗VacA的多克隆抗体。之后,我们分别将诱导表达的*。召和mcD PAGE胶切下,用中性脱色液调整pH值,免疫成年纯种新西兰大白兔,共免疫注射四次。用Western七lot方法测定血清效价,His。o抗血清的效价为1:1000~l:10000;HIS厂D的为1:10000~l:100000。同时用亲和纯化、并复性的*厂B检测正常人和部分上消化道疾病患者血清中抗VaCA的抗体,在285份血清标本中,有77份为阳性,阳性率为26.9%,其中正常人血清阳性率为 28%K7八);十二指肠球部溃疡患者血清的阳性率为14%口14);胃渍疡患者的为22%C9X 胃炎患者的为38%*侣卜 胃癌患者的为33W6川8):食管癌患者的为22W12乃5h 上消化道出血患者的为14%*厂;另有6份其它疾病患者的阳性率为67%w6卜我们根据真核表达载体pIRES厂EGFP多克隆位点的内切酶顺序,重新合成四对引物,在获得的原核重组克隆载体pGEMwacA基础上,扩增vacA基因六个片段爬、NC、ND、NE、NG和NH卜测序证实与文献报道的完全一致,将它们分别克隆入真核表达载体pIRES。-EGFP,构建带有绿色荧光蛋白pFP)标签的重组真核表达载体pIRES。-NvacA,将重组质粒转染到HeLa细胞,检测具有空泡毒素活性的片段,通过透射电镜观察可知,片段NB和NG具有空泡毒素作用,并且片段5第四军医大学博士学位论文NB是本研究的最小空泡毒素活性片段。ELISA的血清学检查是 Hp流行病学调查的首选方法,而疫苗接种是有效控制和彻底消灭蜘感染的最佳途径。本文分段克隆、表达了与协感染者发病密切相关的空泡毒素基因。在此基础上制备抗空泡毒素的抗血清,并用临床血清检测重组蛋白的抗原性。同时构建重组真核表达载体,借助于基因转染检测具有空泡毒素活性的片段。为进一步在临床上通过检测血清中抗体筛查伽感染者和制备蜘疫苗用于协感染的预防和治疗奠定基础。……   
[关键词]:幽门螺杆菌;空泡毒素基因;聚合酶链式反应;表达;抗血清;绿色荧光蛋白;基因转染ELISA
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2001年