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乙型肝炎病毒体外游离复制模型的建立和药效学应用

刘厚佳

  乙型肝炎是一种高发性传染性疾病,由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染肝细胞后引起的。HBV感染后,由于免疫反应过程中的识别错误,机体无法将病毒清除,导致病毒在肝细胞内复制,由机体的免疫反应造成了肝细胞的损伤。病毒感染在乙型肝炎的发病机制中是最初的诱发因素,通过研究病毒感染、复制、表达的过程,寻找适当的作用靶点,筛选高效低毒的药物,直接从发病的源头遏制乙型肝炎的发生、发展是比较理想的思路。同时,现代分子病毒学的发展又为这一思路提供了必要的技术支持。HBV全长或部分片段DNA转染肝癌细胞的实验模型在HBV的体外实验研究方面应用最为广泛。该类实验工具极大的促进了抗HBV药物筛选,但是由于其建立绕过了病毒与肝细胞膜的相互作用,而使得药物筛选的范围缩小;同时,它含有整合型的HBV DNA,所以无法评价停药后病毒复制的反跳,显示出其不足之处。本研究采用HBV阳性病人血清在体外分别感染肝癌细胞及原代成人肝细胞,在感染的原代肝细胞的培养上清中获得了HBsAg、HBeAg、HBV DNA的表达、在细胞浆中获得了HBV DNA的表达,建立了HBV感染宿主细胞的模型。在感染肝癌细胞时,我们考察了感染过程中血清浓度、刺激因素、宿主细胞等因素对于感染的影响,结果表明:选择10%HBV血清浓度、地塞米松和胰岛素为刺激因素、HepG2细胞系作为受体细胞,在这种条件下,所得到的病毒复制标志物的滴度比较高。我们在感染肝癌细胞培养上清中获得了HBsAg、HBeAg、HBV DNA、HBV DNAp的表达、在细胞浆中获得了HBV DNA的表达,并对其进行了形态分析;此外,我们还将HBV感染肝癌细胞的所得到的实验结果同HBVDNA转染的肝癌细胞系(HepG2.2215)进行了比较,结果表明:感染细胞同转染细胞系类似,可以分泌一定量的病毒复制标志物,但是在抗原滴度等方面与转染细胞有较大的差距。我们应用该实验模型和HepG2.2215细胞系分别考察了木瓜1、2、4、5和虎杖甙、苦豆碱、霉酚酸等药物的抗HBV药效,结果表明:在转染细胞系HepG2.2215中,木瓜1、2、4、5和虎杖甙对于HBV的复制具有一定的抑制作用,而霉酚酸和苦豆碱则未见抗HBV效果;但是在感染细胞中,后两者均显示出一定的抗HBV效果。上述实验结果表明:①感染细胞与转染细胞虽然都可以分泌病毒复制标志物,但是其中病毒的生活史是不同的,在转染细胞中,病毒是以整合形式存在的,其复制过程中不包括病毒的粘附、穿膜等过程,而在感染细胞中,病毒是以类似自然感染状态进行复制的。这种差异造成了药物筛选结果的不同:②木瓜作为传统中药,其中的单体成分对**V复制具有一定的抑制作用,这为木瓜治疗黄疽型肝炎的临床应用提供了实验证据,同时也为把木瓜作为抗HBV药物进一步开发提供了基础;②霉酚酸和苦豆碱对HBV复制具有一定的抑制作用,但是在转染细胞系中没有表现出来,说明霉酚酸和苦豆碱的抗HBV作用是通过作用于病毒游离复制过程中的某一步骤发挥效果的,霉酚酸的这一作用步骤很可能就是其发挥兔疫抑制作用的步骤,即降低dGTP和GTP的量,影响病葛聚合酶的活性,而苦豆碱的起效步骤可能就是病毒脱壳、穿过细胞膜的过程。本研究建立了HBV体外感染肝细胞和肝癌细胞的实验模型,观察了影响感染的4种因素,将感染细胞与转染细胞进行了对照,并应用这两种模型观察了数种药物抗HBV的效果。研究表明:肝细胞和肝癌细胞在体外对HBV颗粒敏感,木瓜1、2、4、5、虎杖贰和霉酚酸、苦豆碱对HBV复制有抑制作用,而且两类药物发挥功效的机制是不同的。……   
[关键词]:乙型肝炎病毒;肝细胞;肝癌细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第二军医大学2001年