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人红细胞嘧啶5’-核苷酸酶蛋白的分析鉴定、微量测序及其cDNA文库的构建

潘竹林

  人红细胞嘧啶5 -核苷酸酶(EC3.1.3.5.P5 N)缺陷可导致遗传性非球形细胞溶血性贫血。其发病率占所有遗传性红细胞酶病中第三位。至今己报道35个家系,约70多例。目前已发现P5 N有两种同工酶:和P5 N-Ⅱ,仅P5 N-I缺乏可引起溶血性贫血,而P5 N-Ⅱ的活力正常,其发病机制仍未完全阐明。为进一步研究其生化特性,获得P5 N的cDNA序列,进而得出该酶的蛋白质一级结构,以进一步探讨其发病机制。我们在纯化P5 N-Ⅰ的基础上,对该酶蛋白进行了分析鉴定和微量测序,对一例遗传性P5 N-I缺陷症家系进行追踪调查,并构建了相应 cDNA文库。方法:一、建特异性亲和层析柱,纯化人红细胞P5 N-Ⅰ。二、对纯化的P5 N-Ⅰ分析鉴定、微量测序及氨基酸组成分析1、对纯化的P5 N-IESI质谱分析。2、通过将纯化的P5 N-I液直接送检;转至PVDF膜的P5 N-Ⅰ液;经胰蛋白酶水解,HPLC收集水解片段进行微量测序。3、将所测序列进行生物信息学分析,寻找同源性片段。4、将纯化的P5 N-Ⅰ液经酸水解后,进行氨基酸组成分析。三、对一例遗传性P5 N-I缺陷症家系进行酶活力、酶蛋白定量及外周血红细胞形态调查,并将其白细胞冻存,保存基因资源。四、用经G-CSF、GM-CSF动员后分离的正常人外周血CD34+细胞作为mRNA来源,构建PCR介导的cDNA文库。结果:一、交联率40%,达到了亲和层析纯化蛋白所要求的标准。纯化蛋白SDS-PAGE示单一条带。二、对纯化的 P5 N-I分析鉴定、微量测序及氨基酸组成分析1、对P5 N-I的分子量质谱分析为26952.5,同时发现存在另外两种蛋白片段,分子量分别为55476及110938。两者分别为酶分子量的二倍及四倍。2、对该酶蛋白微量测序表明,其蛋白质分子中含有Ile(异亮)-Glu(谷)且第二军医大学长海医院血液科博士毕业论文一中文搁要一Gly(甘)一Pro(脯)一Thr(苏)一lie(异亮)一Arg(精)一GIN(谷恍)一lie(异亮)一Gin(谷)序歹。3、经blast进行相似性搜索,未发现同源性片段。4、氨基酸组成分析示:该酶蛋白至少由18种氨基酸,约243个氨基酸残基组成。三、家系调查结果表明:发现一例杂合子,其酶活力下降至正常值50%,酶蛋白定量亦下降至正常值50%以下。四、cDNA文库的容量为2.8x10’pfu八g,插入片段全长性占77.5儿 平均长度为1235hP。结论:l、正常人红细胞PS’N-I生理状态下,可能为一种变构酶,以同源四聚体的方式发挥作用。2、所狈部分氨基酸序列(lie-Gin-Gly-Pro-Thr-lie-Ars-GIN-11e-Gin),在数据库中未发现同源性片段,该序列可作为筛选目的基因的探针。所测氨基酸组成为确定其蛋白一级结构提供了重要依据。3、除测定PS’N-I活力外,测定陀’N-I酶蛋白含量可成为一种检测杂合子的潜在方法。4、经对构建的cDNA文库进行检测,证明己达到构建完整cDNA文库对库容量。完整性及全长性的要求,可用于下一步目的基因的筛选。……   
[关键词]:红细胞;嘧啶5'-核苷酸酶;cDNA文库
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第二军医大学2001年