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对鳞翅目害虫高毒力Bt菌株B-Hm-16和B-Pr-88的分子生物学研究

李长友

  鳞翅目害虫是重要的农业害虫,苏云金芽孢杆菌是目前防效显著、应用广泛的微生物杀虫剂。深入发掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源,分离克隆新型高毒力的杀虫蛋白基因,对构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论和实践意义。本研究对国内不同来源的133株Bt菌株的cry基因进行了PCR-RFLP鉴定。研究结果表明,61株菌含有cry1基因;59株菌含有cry2基因;15株菌中含有cry9基因;13株菌中同时含有cry1,cry2,cry9三类基因,2株同时含有cry1,cry9类基因;在所有菌株中均未发现cry3、cry4、cry5、cry8和cry11基因。在此基础上,对鳞翅目害虫具有高毒力的Bt菌株B-Hm-16和B-Pr-88的生物学特性进行了系统研究。B-Hm-16主要形成钝菱形晶体,B-Pr-88有菱形、球形和不规则形等多种晶体形态;两株菌的酯酶型与标准菌株蜡螟亚种和库斯塔克亚种一致,同属于galleriae型;10项生理生化反应结果表明,B-Hm-16与标准菌株鲇泽亚种反应一致,B-Pr-88与蜡螟亚种一致;B-Hm-16杀虫晶体蛋白主要为130kDa,B-Pr-88的晶体蛋白由130kDa和60kDa两种组成;B-Hm-16和B-Pr-88菌株分别含有7种和3种质粒,它们的杀虫晶体蛋白基因均定位于质粒DNA上。分别采用Southern blotting定位克隆和PCR扩增等方法,从B-Pr-88菌株中分离克隆了5种杀虫晶体蛋白基因。其中4个基因已在GenBank注册登记并分别获得Bt基因国际命名委员会正式命名:cry1Gb2(GenBank序列注册号:AF288683)、cry1Fb5(AF336114)、cry1Db2(AF358862)、cry2Ab4(AF336115)。cry1Gb2位于9.0kb PstI DNA片段,编码区全长3510bps,编码1169个氨基酸残基,蛋白分子量为133.0kDa;cry1Fb5开放阅读框架(ORF)全长3525bps,编码1174个氨基酸,蛋白分子量为133.4kDa;cry1Db2编码区全长3483bps,编码1160个氨基酸,cry1Db2分子量为131.0kDa;cry2Ab4编码区全长1902bps,编码633个氨基酸,蛋白分子量为70.7kDa,为弱碱性蛋白。另一个基因cry9Ba是通过PCR特异扩增获得的,其编码区全长3354bps,编码1117个氨基酸,蛋白分子量为126.4kDa,cry9Ba基因正在申请注册。序列分析结果表明cry9Ba、cry2Ab4、cry1Gb2和cry1Db2与已发表的基因在氨基酸序列上均有不同程度的差异,属于新的cry基因。W%以穿梭质粒pHT315为载体构建了 B-Hm-16菌株的质粒 DNA文库,分离克隆了两种杀虫蛋白基因,已在GenBank登记注册并获得Bt基因国际命名委员会正式命名,它们分别是Cry1Ab1)(AF358861)和 CrygEaZ(AF358863)。Cry1Ab1)编码区 3468bps,编码 1155个氨基酸,蛋白分子量为门0石oa;Clyha Ogy全长3453bps,编码 1150个氨基酸,蛋白分子量为129·gtoa。后者是我国分离克隆、并获得正式命名的第一个Cryg基因。此外,对Cry1Ab1)基因DNA大片段序列分析还发现在其上游有一个编码318个氨基酸的开放阅读框架,与枯草芽抱杆菌(BQCIHto SubtiliS)细胞壁水解酶---N-乙酞胞壁质士丙氨酸酚胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)氨基酸序列有70%的同源性,在Bt中该基因的序列还未见正式报道。根据克隆基因的O肝序列,分别设计合成6对特异引物使PCR扩增出的CIy1Fbs、cry1DbZ、以厂Nb4. cryPBa、cry1Ab1)和 crvgEaZ各基因与表达载体 pET-Zlb正确连接:cry1GbZ基因经 Ndel和 BamHI双酶切后与 pETZlb连接。将它们分别转化大肠杆菌菌株BLZI(DE3LSDS-PAGE均检测到这些基因所表达的相应大小的蛋白。将含Cry1Ab1)基因的重组质粒pLG28和含Clyha基因的重组质粒pBIG366分别电击转化Bt无晶体突变株BE20,转化子都形成了菱形晶体,SDS-PAGE检测证实130kDa蛋白的存在。上述基因的表达产物室内杀虫生物测定结果表明,CryZAb4对小菜蛾、二化螟、棉铃虫具有杀虫活性,其中对棉铃虫 LC扣达到 23.7pg/g(蛋白与饲料干重比L与 HD刁3的CrylAC相近(LC。。为 15.Zllg/g)。该基因可作为棉铃虫防治和抗性治理新的基因来源。CrylFbs对小菜蛾、棉铃虫、二化螟等害虫96小时的校正死亡率分别是43.3%、25石%和35刀%。CrylAbls对小菜蛾等多种害虫表现出高毒力,以lpg/ffiL的浓度处理二龄小菜蛾幼虫,48小时的死亡率达到 100%,对甜菜夜蛾初孵幼虫 96 /J’时的 LC扣为 3.59pg/g。尚未发现CrylGbZ、CrylDbZ和 CrygEaZ对棉铃虫、小菜蛾、二化螟、玉米螟和甜菜夜蛾有明显活性,它们的目标害虫和毒力有待进一步研究。……   
[关键词]:苏云金芽孢杆菌;cry基因;基因克隆;鳞翅目害虫
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:东北农业大学2001年