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植物抗病毒基因工程研究 Ⅰ黄瓜花叶病毒复制酶基因表达载体构建和遗传转化 Ⅱ导入病毒基因的转基因植物释放的风险评估

温瑞

  根据已发表的黄瓜花叶病毒(CMV)Fny RNA2基因序列,设计了全长的2a复制酶(Replicase)基因的特异引物,以CMV Fny RNA2 cDNA的克隆pFny209为模板,进行PCR扩增,得到全长2.5kb的2a复制酶基因扩增产物(RP)。对此产物进行纯化,并用NcoⅠ和BspHⅠ进行双酶切,得到三个片段。将不含有GDD保守区的两个片段用T4 DNA连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到2.2kb左右的缺失GDD保守区的CMV 2a复制酶基因扩增产物(RP△GDD)。以CMV P1 RNA2基因组为模板,根据CMV Fny RNA2基因组的发表序列设计引物,进行PCR扩增,得到5 端及3 端分别缺失的2a复制酶基因(P1-RP)。将三个不同长度的2a复制酶基因片断克隆到pGEM-T Easy Vector上,筛选获得重组质粒pTEVRP、pTEVRP△GDD和pTEVP1-RP。对重组质粒进行序列测定,结果表明序列正确。将三个复制酶基因重组于植物表达载体中,构建植物基因转化载体系统。用SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒pTEVRP和pTEVRP△GDD双酶切,获得全长的(RP)及缺失GDD保守区的2a复制酶基因片段(RP△GDD);用SmaⅠ和XbaⅠ对重组质粒PTEVP1-RP双酶切获得5 端及3 端分别缺失的复制酶基因片段(P1-RP)。将这些目的基因片段定向克隆到植物表达载体pBI121中,PCR及酶切鉴定重组质粒正确。由此获得了不同长度的2a复制酶基因的植物表达载体pBIRP、pBIRP△GDD和pBIP1-RP。通过三亲交配法分别将三个植物表达载休导入根癌农杆菌EHA105中,PCR及酶切鉴定,证实质粒均已导入农杆菌菌株。通过叶盘转化法,获得了转化CMV P1-RP基因的烟草植株。对10株转基因烟草进行PCR检测,9株能够扩增出目的基因。取PCR鉴定为阳性的3个植株,进行Southernblot印迹分析,其杂交结果均为阳性,该结果表明CMV P1-RP基因已整合于烟草基因组DNA中。对3株烟草的Northern blot印迹杂交结果也为阳性,表明转入烟草的CMVP1-RP基因已在受体植物中转录表达。建立了番茄亲本B-1的遗传转化体系,找到了适宜番茄B-1分化的培养基及最佳l激素比率,芽的分化率(叶盘上形成的芽数与叶盘的比)可达500%以上。l通过叶盘转化法,同样获得了转化CMV Fnv全长的 Za复制酶基因的番茄植株。l对10株转基因番茄进行PCR检测,有7株能够扩增出目的基因。取3株PCR鉴定为l阳性的植株,进行 S。uthm hi仇印迹分析,其杂交结果均为阳性,而且其中 1株存在l多拷贝,表明 CMV Ffiy Za复制酶基因已整合于番茄基因组 DNA中。对 3株番茄的INorthern blot印迹分析发现2株杂交信号为阳性,表明转入番茄的CMV Ffly Za复制D酶基因已在部分受体植物中得到表达。l用 CMV PI株系和 CMV RB株系接种转基因植物,通过症状观察和 ELISA检测,l转基因植株有三种不同的抗性反应。即症状严重型;症状延迟型;无症状型。ELISAl测定结果也表明,一部分转基因植物对CMVPI株系和CMVRB株系没有抗性;一部D分转基因植物具有延迟发病作用;少部分转基因植物具有抗病作用。有关抗性机理的0研究正在进行中。D导入TOMV、TMV移动蛋白基因的烟草和导入CMV PI-RP复制酶基因的烟草,分【别经组织培养扩繁并移栽于温室中。4-5叶期分别接种CMVRB株系、PVX、PVY、lITMV,并以非转化普通烟为对照。症状观察表明,病毒在转基因植株上的症状与对照植lD株上的症状无明显差异,ELISA测定也表明转化植株体内病毒的含量与对照相近。将导入ToMV移动蛋白基因的烟草接种TMV,一个月后取其系统叶接种心叶烟D和三生烟(NN基因型),并以TMV接种心叶烟和三生烟为对照。症状观察结果表明l两者接种的JL’叶烟和三生烟病斑大小相近、病斑颜色相同。随后10个月中定期取系统D叶接种心叶烟和三生烟,观察病斑大小的变化,没有发现所转基因与接种病毒之间的D重组。将导入CMV PI.RP复制酶基因的烟草接种CMV RB株系,一个月后取其系统l叶接种蚕豆,并以CMV RB株系接种蚕豆为对照。结果表明两者接种的蚕豆病斑大小l相同。随后6个月中定期取系统叶接种蚕豆,观察病斑大小的变化,也没有发现所转0基因与接种病毒之间的重组。D……   
[关键词]:黄瓜花叶病毒;烟草花叶病毒;番茄花叶病毒;转基因;抗病性;复制 酶;移动蛋白;风险评估;烟革;番茄
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2001年