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幽门螺杆菌外膜和甲硝唑结合作用与耐药性关系的研究

胡伟玲

  自从1982年澳大利亚学者Marshall和Warren从人体胃粘膜活检标本中分离出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori简称H.pyroli)以来,大量研究表明,H.pyroli是慢性活动性胃炎、消化性溃疡发病的主要病因,并与胃恶性肿瘤(胃癌、胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤)关系密切,WHO和国际抗癌联盟将其列为Ⅰ类致癌物,因此根除H.pylori对治疗和预防这些疾病十分重要。甲硝唑在胃内有较高的稳定性和较强的抗H.pylori活性,是最早用于治疗H.pylori的抗生素之一。甲硝唑进入H.pylori后,在胞浆中的硝基还原酶作用下,被还原为有活性的代谢产物,破坏细菌的DNA,导致细菌死亡。随着甲硝唑的应用,H.pylori对其耐药现象日趋严重。有文献报道,美国及西欧一些国家H.pylori的甲硝唑耐药率为10%-30%,而包括我国在内的发展中国家则高达70%-90%。故探讨H.pylori对甲硝唑的耐药机制,进而研究耐药性的逆转具有十分重要的意义。目前,国内关于H.pylori对甲硝唑耐药机制的研究尚不多见。最近发现,编码H.pylori硝基还原酶的rdxA基因的突变失活与甲硝唑的耐药有密切关系。另外,Kwon等研究表明编码黄素氧化还原酶的frxA基因和编码铁氧化还原酶样蛋白的fdxB基因的失活也浙江大学硕士学位论文D能引起小问桂度的耐蓟。而我们先前的研究结果表明质子泵抑制剂D冶蚕兄训比岗丁伯饥刑维沤阳术通辽刊J刷H.pylorE%蜀物泉,减少D约物外排,对H.pylon的耐药性有良好的逆转作用,显示了膜耐药D是 H.pylon严主耐约的机制之一,但有关 H.pylon耐药株外膜和甲硝脏姑会作 田 曰 前 尚干m 右抿滔十寸MS 甲wwA6n口 队Jt上D川:坝 口1卜 川 口 日uIW 小儿月 狐迟。小大狈木川 附脐兄没叹 附沽D(ELISX 对H.pylon外膜和甲硝哩结合作用进行研究,并探讨其1与耐约性的夭系。另外,提取N.pylon甲硝哇敏感株和耐药株的相D关蛋白,对其蛋白成分进行比较。D1.菌株和培养:敏感菌取ATCC4%29,耐药菌为临床分离菌株,采用p yi o r i培养基在微需氧条件下3 7 t孵育7 2’h时,N伦比亚tRI养某扩大培羌。D2.最小抑菌浓度(MIC)的测定:纸片法DD3.甲硝哩和午血清蛋白(BSA)了联物的制各;m碳二丁肪注。DI4.ELISAis测H.Pylon外膜和甲硝哩的结合作用及抑制试验:取l中硝陛-BSA交联物,包破微孔,4℃过夜,坎日取出,磷酸热梁冲D汲(PBS)洗涤徽孔3次,用10%小牛血清3 7 t封闭30min,加入D细菌,对照组加入 20 UI的生理盐水,抑制组加入甲硝哇溶液 20UIl(终浓度为500 ug/ml),37t微需氧反应Zh,洗涤3次,加入10%I泳素水淆汲37℃反应Zh,吸出上渭液50ul,加入奈氏试剂200ul,l至温放置5秒后,用酶标仪570mm比色,结果以吸光&(OD佰)表Iw。DS.敏感菌和耐药菌外膜与甲硝哇结合作用的比较:实验步骤同上,D敏感组加入敏感菌,耐药组加入耐药菌。I6.细菌的裂解:用10%SDS裂解甲硝陛敏感菌和耐药菌,离心后D7.甲石自哩汞和层机拄:用1.旭S叩加***e*B 装拄,用中力肖哩才口I-3-D浙江大学硕士学位论文DDSePharose4B交联,制成柱型为scm XI cm亲和层析柱,解祈液为0·lmol/L pH 2.吕甘氨酸盐酸溶液。18.SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE):参照Leamm卜 不连ll续电泳法,选用6%浓缩胶和8%的分离胶,初始电压为60V,待ll样本进入分离胶后,电压改为 80V,电泳结果采用银染色。l1.*IC:敏感菌:8呛切!,耐药菌:>25叩加!。2.H.pylon 外膜和甲硝哇的结合作用及抑制试验:甲硝哇-BSA包被微孔后,甲硝哗只能和H.pylon 外膜结合,不能进入细菌,l随着细菌浓度的下降,OD值也下降,在抑制试验中,抑制组的ODD值比同细菌浓度的对照组明显下降(P<0.001)。D13.敏感菌和耐药菌外膜与甲硝哩结合作用的比较:耐药菌组的吸lD光值明显低于敏感菌(P<o.00)。DD4?……   
[关键词]:幽门螺杆菌(H.pylori);耐药机制;lD 甲硝哇;外膜;结合作用
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2001年