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葡萄扇叶病毒杭州分离物生物学特性和基因组结构研究

李红叶

  1.从浙江大学实验果园表现类似葡萄扇叶病症状的葡萄(Vitis vinifera L,品种巨峰)上分离到一种直径为28-30nm的球形病毒。病毒粒子接种苋色藜(Chenopodium amaranticolar)呈现局部褪绿黄斑和系统褪绿斑驳,症状易随植株生长而消失;感染昆诺藜(C. quinoa)除呈现上述症状外,新生叶的叶缘常呈坏死状扭曲畸形,症状不易随植株生长而消失;在菜豆(Phaseolus valgaris cv.Bountiful)呈系统症状,三生小叶花叶,扭曲畸形。该病毒不感染黄瓜(Cucumis sativus)和多种烟草(Nicotiana spp.)。ELISA和免疫吸附电镜研究表明,所分离的病毒能与来自德国和法国的葡萄扇叶病毒抗血清产生反应。SDS-PAGE电泳和免疫印迹杂交表明该病毒的外壳蛋白为为单亚基,分子量约54kDa;RNA变性电泳结果显示病毒基因组为双组分RNA,其大小分别为7.3kb和3.7kb。根据已报道的葡萄扇叶病毒分离物F13的外壳蛋白核苷酸序列合成引物,采用RT-PCR可扩增到一条大小约1.5kb的条带。根据以上结果可以确定所分离的球形病毒为葡萄扇叶病毒的一个分离物,命名为GFLV-H(杭州分离物)。2.从国内曾报道有葡萄扇叶病的中国科学院香山植物园、山东农业大学实验果园和本校实验果园等地的病株根围采集土样,进行线虫的分离鉴定。发现所分离的剑线虫属线虫主要是Xiphinema insigne Loos其次是X. brevicolle lordello & Da Costa。对出现频率高的线虫X. insigne进行反复的传毒试验,表明X. insigne不具传播GFLV-H的能力。根据本试验结果,并结合病毒的田间分布,推测我国并不存在葡萄扇叶病毒的自然传播介体线虫。3.根据GFLV-F13 RNA2的已知序列和多聚蛋白切割位点,合成涵盖病毒外壳蛋白和移动蛋白基因的核苷酸序列的特异性引物,用RT-PCR技术从GFLV-H病毒基因组中扩增到一条2.5kb左右的条带,并对此条带进行了克隆和序列测定。序列测定发现此2.5kb cDNA包括2559个核苷酸,编码852个氨基酸。将推导GFLV-H外壳蛋白氨基酸序列与已知的其他6个GFLV外壳蛋白氨基酸序列进行的多序列比较发现,它们之间的同源性很高,都在90%以上。与其他9种线虫传多面体病毒属(Nepovirus)病毒的CP氨基酸序列进行同源性比较,发现GFLV-H CP只与南芥菜花叶病毒(ArMV)的CP有较高的同源性(69%),与其它8种nepoviruses CP的氨基酸同源性均在30%以下。浙江大学博士学位论文推导的GFLV叫移动蛋白氨基酸序列与其他5个nepovirnses的对应区域多序列比较发现 GFLV-HMP /q与番茄环斑病毒(TomRSV)MP有较高的同源性(38.5y),与其他4个种的同源率均在30%以下。在这些nepoviruses MP上游区段的疏水域叩基序)发现一个辅氨基残基。p基序在 COmO一、C。pillo-和 C。limOVirUSeS病毒中也存在,已经明确这些病毒是通过由移动蛋白参与构成的管状结构作胞间移动。4.电镜观察了葡萄扇叶病毒侵染觅色黎(Camrantfco1Or和昆诺黎Kquinoa)的细胞超微结构变化。病毒粒子存在于叶肉组织薄壁细胞的细胞质内,常成单纵列排列在小管结构中,小管形成聚集体。在系统感染的昆诺黎细胞中位于管状结构中的病毒粒子穿过胞间连丝。两种细胞质内膜结构增生,形成含细纤维状物质的小囊泡,液泡膜边缘存在少许小泡,有多泡体和髓鞘样结构伸入液泡,叶绿体和线粒体等细胞器也发生明显的病变。Western blot表明来自法国的GFLV-F13 P38(移动蛋白)重组蛋白兔抗血清能与 GFLV十移动蛋白产生反应。利用 GFLV干 P38蛋臼抗体,通过兔疫胶体金将GFLV-H移动蛋白定位于靠近细胞壁的细胞质、细胞壁、胞间连丝和管状结构的表面,结合组织病变研究发现病毒粒子可以在管状结构中通过胞间连丝,进一步明确了P38蛋白与病毒的在胞间扩散有关。5.本研究克隆了GFLV十外壳蛋白基因,并构建包含该基因的植物表达载体,通过三亲交配法将该基因导入农杆茵LBA4404中。以鲜食葡萄白香蕉无菌苗的茎段为材料,诱导产生胚性愈伤组织,再以胚性愈伤组织为外植体,开展对葡萄的遗传转化研究。以胚性愈伤组织与农杆菌共培养2天后进行除茵处理,接着在胚状体分化培养基上预培养,再转人含Kan的筛选培养基中进行筛选,所获得的抗性胚性愈伤组织转入成梢和生根的培养基中,大约2个月后,长出少量小植株,对其中7株小植株进行PCR鉴定,其中4株显示PCR阳性反应。对这些阳性植株正在继续培养观察,进一步的Southe,n,Northern分析有待小苗稍大一点时进行。……