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茶树多酚氧化酶基因的克隆和转化系统研究

赵东

  茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是我国重要的经济作物之一。茶叶富含多种次生代谢产物,其中多酚类物质具有多种重要的生理功能,在食品和医药等行业具有巨大的应用潜力。多酚氧化酶与茶叶加工密切相关,不同的茶叶类型需要不同的多酚氧化酶活性,如加工红茶的品种需要较高的酶活性,而生产绿茶则希望有低的酶活性。本项研究重点在茶树多酚氧化酶基因的克隆和茶树遗传转化系统方面,结果如下。根据已经发表的多酚氧化酶基因中的保守序列,设计兼并引物,利用nest-PCR技术,首次在茶树中克隆了多酚氧化酶基因。该基因已经在GenBank上登录,登录号为AF269192。序列分析表明,茶树多酚氧化酶基因与其他植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性,尤其在铜离子的结合部位,所有的植物基本上一致。进化树分析表明,茶树的多酚氧化酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组。通过对茶树茎培养的激素水平和相互关系的研究,以叶片数为生长指标,初步明确了茶树茎培养所需的激素条件。统计结果表明,NAA和BAP的浓度对培养材料的影响很大。在培养的早期,不同浓度的NAA对茎生长作用效果不甚明显,未达到统计上的显著水平。但随着生长的进程,NAA的浓度效果逐渐显现,即不同浓度的NAA对生长的影响显著不同,在统计上达到极显著水平。与NAA的作用效果不同,不同的BAP浓度对茶树茎生长的作用一直有着极显著的效果差异。同时通过统计分析还首次发现了NAA和BAP对茎的生长没有互作作用。研究表明,茶树茎培养的较为适宜的生长调节剂浓度为BAP 2.5-5mg/L、NAA 0.5-1mg/L,在这个浓度条件下,经过60天的培养,一个茎最多可生长到15片叶片。我们以GUS的瞬间表达为指标,对根癌农杆菌介导的茶树转化系统l的影响因子进行了研究。由于 30 ml/L的卡那霉素即能够有效地抑制茶l树叶片愈伤组织的发生,因而对以Kan为筛选标记的表达载体来说,150mg/L Kan是较为适宜的选择浓度。我们比较了三种不同染色体遗传背D景的根癌农杆菌对茶树叶盘的侵染情况,发现侵染效果的差别不大。在l侵染过程中采用真空处理反而会降低GUS的瞬问表达。从试验结果看,l茶树较为适宜的根癌农杆菌转化系统是用 ODm。为 0.5刀.8的 LBA4404D侵染茶树叶盘10分钟左右,在暗中28T共培养T3天。硝酸银对农杆菌D生长有抑制作用,不宜在共培养阶段添加。……   
[关键词]:茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze);多酚氧化酶基因;NAA;BAP;转化系统
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2001年