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赖氨酸脱羧酶对水稻白叶枯病菌有机酸毒素的解毒作用及其基因的克隆和表达研究及草酸解毒菌的初步研究

吴健胜

  毒素作为植物病原菌一种重要的致病生化因子,对于植物病害的形成与发展具有重要作用。利用解毒作用对植物病害进行控制,是植物病害生物防治的途经之一。有机酸是植物病原菌产生的一类小分子代谢产物,对植物的生长与发育具有毒性作用。本课题针对水稻白叶枯病菌产生的有机酸毒素,通过解毒菌或解毒酶解除或减轻其毒性,探讨它们在病害防治中的应用价值,并评价解毒途经防治有机酸毒素介导病害的的可行性。水稻白叶枯病菌能够产生有机酸毒素,这些毒素能够引起烟草叶片坏死。本研究室发现:水稻白叶枯病菌能够产生解毒蛋白,该蛋白具有脱羧酶的生化功能。根据该发现,考虑到水稻白叶枯病菌有机酸毒素底物,选取已知基因序列的商品酶5种:精氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶、草酰乙酸脱羧酶和延胡索酸酶,探讨它们可能的解毒作用。一定浓度的待测酶与来源于水稻白叶枯病菌日本小种JXOⅢ菌株的毒素在合适条件下保温一定时间后,注射接种烟草,2周后观察酶对毒素毒性的影响。结果表明:赖氨酸脱羧酶具有明显的解毒作用,草酰乙酸脱羧酶具有一定的解毒作用,但不够稳定,其它3种酶无明显作用。这一结果得到了进一步的验证。为了探讨解毒酶在防治水稻白叶枯病的应用价值,在上述研究基础上,构建了赖氨酸脱羧酶工程菌株。以蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)染色体为模板,用PCR方法扩增出2.2kb赖氨酸脱羧酶基因片断,将其连接在大肠杆菌高效表达载体pTrc99A,构建重组质粒pLDC。用氯化钙法将pLDC导入大肠杆菌HB101,从156个转化子中筛选得到重组克隆8个,通过进一步鉴定,得到阳性克隆1个(HB101/pLD151)。HB101/pLD151赖氨酸脱羧酶活性是蜂房哈夫尼菌原始菌株的10倍。SDS-PAGE蛋白分析表明,HB101/pLD151表达的赖氨酸脱羧酶占细胞可溶性总蛋白的16.5%。HB101/pLD151能够解除水稻白叶枯病菌毒素对烟草的致死作用,能够解除水稻白叶枯病菌毒素对水稻出苗的抑制作用。本研究结果为赖氨酸脱羧酶对水稻白叶枯病菌毒素的解毒作用提供了进一步的遗传学证据。重组蛋白的分子量大约为53kd,比预计的83kd小,序列分析发现:基因表达在1422处提前终止。进一步将截短的赖氨酸脱梭酶基因1.4kb片断进行了克隆、表达和功能验证。结果表明:蜂房哈夫尼菌赖氨酸脱叛酶基因N端1.4kb片断具有完整的基因功能。草酸在植物病原真菌作为毒素已有大量报道,但在植物病原细菌中研究较少。采用高锰酸钾滴定法,以Xanthomonas、Pseudomonas、Ralstonla、Agrobacterium、Erwinia和 Curtobacterium 6个属为代表,对植物病原细菌产草酸的情形进行了广泛研究,同时研究了黄单胞菌野生型及其毒性基因突变体产草酸的差异。结果表明:植物病原细菌不同属均能产生草酸,但在产量上存在差异。研究发现一种细菌(编号为W八)对草酸、苯乙酸、a-甲基巴豆酸和水稻自叶枯病菌毒素具有主物活性。W-1能消除或减轻有机酸毒素引起烟草的坏死,解除有机酸毒素对水稻出苗的抑制、明显降低水稻白叶枯病的病斑长度。Wd呈棒杆状,G\无芽胞,鉴定为乳酪杆菌属(CaseobactersP.)。*P*C分析结果表明:Wd对草酸具有降解作用。结果表明:W八的生物活性属于解毒活性。田间试验结果表明:人工接种条件下,Wd、HB llpLD151稀释10倍喷雾2次,对水稻白叶枯病的防病效果分别为56.4%、43%。……   
[关键词]:水稻白叶枯病菌;有机酸毒素;解毒作用;赖氨酸脱羧酶;草酸;水稻白叶枯病;防病作用
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2000年