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多粘类芽孢杆菌WY110抗菌蛋白的制备及其基因克隆和表达

姚乌兰

  本研究以分离自水稻根际的一株植物促生菌——多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)WY110作为试验材料,在分离纯化对稻瘟病菌具有拮抗活性的抗菌蛋白P_2并测定其N末端部分氨基酸序列的基础上,确定了P_2蛋白的性质,采用PCR技术克隆了P_2蛋白的编码基因,测定了全序列,并在大肠杆菌中获得了表达。P_2蛋白编码基因的克隆为水稻抗病基因工程提供了有潜在应用价值的新的目的基因。采用抑菌活性检测和SDS-PAGE跟踪检测,通过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephacryl S-200分子筛层析等方法从WY110的发酵液中大量制备并纯化了抗菌蛋白。平板抑菌试验表明,在PDA培养基上1.5μg P_2蛋白即可有效地抑制稻瘟病菌的菌丝生长,P_2对所测试的稻瘟菌不同菌株均表现出抑菌活性。为进行免疫学测定,以纯化的P_2蛋白作为抗原,免疫家兔制备了抗血清。对P_2蛋白的N端测序结果表明,N末端24个氨基酸序列为H_2N-Ala-Asn-Val-Phe-Trp-Glu-Pro-Leu-Ser-Tyr-Tyr-Asn-Pro-Ser-Thr-Trp-Gln-Lys-Ala-Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn-。以此为靶序列在网上用BLASTP程序对蛋白质序列数据库进行了类似性检索,发现其与来源于芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶前体具有很高的同源性。进一步用β-1,3-1,4-葡聚糖酶的特异底物地衣多糖进行了定性检测,验证了P_2蛋白具有此酶活性。本研究发现的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抗真菌活性,国内外均未见报道。在此基础上,根据P_2蛋白N末端氨基酸序列及此酶C端保守性序列设计合成了两端引物,以Paenibacillus polymyxa WY110染色体DNA为模板,通过PCR扩增获得了P_2蛋白编码基因的全序列,并克隆到pMD18-T载体上。核苷酸序列测定表明,其5′端72个核苷酸序列与蛋白N端已知的24个氨基酸序列完全吻合,序列全长636nt,由此推导的氨基酸序列全长212aa。与国外报道的一例来源于Paenibacillus polymyxa的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(Gosalbes M J,1991)相比,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为84%和88.7%。为构建融合蛋白表达载体和获得与天然蛋白质序列完全一致的目的蛋白,以含有目的基因的重组质粒DNA为模板,设计引物时加入两端酶切位点及肠激酶裂解位点,通过PCR扩增引入目的基因中,测序结果表明接头和读框正确。对目的基因进行双酶切后与谷眺甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达载体PGEXIX定向连接,转化大肠杆菌JM 109,成功构建了目的基因的融合蛋白表达载体。经IPTG诱导表达,超声破碎菌体,收获细胞总裂解物;SDS-PAGE结果显示有很强的特异表达产物带。采用谷眺甘肽亲和层析柱纯化GST融合蛋白,经肠激酶特异性裂解释放出目的蛋白。在Western七lotting检测中,此目的蛋白可与P。蛋白制备的抗体发生特异免疫反应。生物活性测定结果表明,目的蛋白具有卜1,3A/-葡聚糖酶活性并对稻瘟病菌具有明显抑菌活性。……   
[关键词]:多粘类芽抱杆菌;稻瘟病菌;抗菌蛋白;β-1;3-1;4-葡聚糖酶 基因克隆;大肠杆菌表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2000年