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大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因介导的抗病毒转基因小麦的研究

吴茂森

  将已知BYDV-GPV部分序列,与其他黄症病毒序列比较,合成相应的上下游引物,以BYDV-GPV株系病毒RNA为模板,RT-PCR分别扩增了GPV株系的ORF1和ORF2基因片段。经过酶切、连接、转化,将2个基因片段分别插入到pUC19质粒之中,获得了重组质粒pUC19-ORF1和pUC19-ORF2。对基因片段进行序列分析结果表明,ORF1全长1953个核苷酸,可编码651个氨基酸、分子量为71.4kD的蛋白质;ORF2全长1872个核苷酸,可编码624个核苷酸、分子量为70.1kD的蛋白。在ORF1和ORF2之间存在着一较长的重叠区域,达601个核苷酸。与其他黄症病毒的序列比较结果,GPV与RPV的同源性最高,ORF1同源性达66.4%,ORF2达81.7%;推测出的编码氨基酸序列,P_1同源性为55.6%,P_2为81.5%。与PAV的同源性最低,核苷酸同源性分别为ORF1/44%,ORF2/42%,并且仅为部分同源;推测的氨基酸序列几乎没有同源性。根据测定的基因序列,分别设计合成相应引物,RT-PCR扩增ORF1和ORF2基因片段,将基因片段分别插入到含Emu启动子的质粒pEmu-mcs-N之中,构建成用于小麦转化的植物表达载体pPPI 12(ORF2重组质粒)和pPPI 13(ORF1重组质粒)。利用花粉管通道途径分别转化了小麦品种陕160、陇鉴127及晋麦47、京冬8号。对得到的转化种子经过卡那霉素抗性筛选、田间直接抗病性筛选、Dot blot、PCR检测和Southern分析,最终得到3个阳性的T_1代ORF2转基因系。其中2个为陕160转化后代,1个为陇鉴127转化后代。温室和田间的抗病性鉴定,陕160转基因系表现出具有高度的抗性,在对照植株严重发病时不表现症状或仅出现轻微的叶尖发黄症状;陇鉴127转基因系可达到减轻症状的效果,在对照叶片全部黄化时,仍能保持旗叶不发病或发病面积小于1/3。ORF1基因转化后代中没有检测到Southern阳性中国农业科学院博士学位论文的转化株。缺失OgyZ基因转化小麦收获的转化种子,经过卡那霉素筛选、PCR检测和Southern分析,陕160、晋麦47和陇鉴127三个品种的转化材料,仅在晋麦47后代中得到了阳性的转化株,TI代Southern检测中,2个转基因系获得了阳性的结果。转基因材料进行的田间抗病性鉴定结果,表现出椎迟发病减轻症状的效果。……   
[关键词]:大麦黄矮病毒GPV株系;复制酶基因;序列测定;花粉管通道;小麦转化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2000年