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H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究

刘明

  本文根据禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)核蛋白(NP)基因核苷酸序列,设计合成了NP基因特异的引物NPF/R。不需要经过病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中用Trizol试剂提取病毒核酸,采用RT-PCR技术可以扩增出326bp的NP基因片段。采用引物NPF/R对14个亚型禽流感病毒标准参考株,4个亚型12株国内分离野毒株进行RT-PCR,都能特异的扩增出扩增326bp左右的目的片断,采用地高辛标记的NP基因探针进行斑点杂交,结果证明了PCR产物的特异性。新城疫病毒、法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒RT-PCR扩增结果都呈阴性。禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/African Starling/England/983/79(H7N1)人工实验感染鸡病料的RT-PCR检测结果与鸡胚病毒分离结果分别为34/42、32/42;24/55、24/55符合率在95%以上。RT-PCR最少可以检测到10pg的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行RT-PCR检测,只用6个小时就得出确实的诊断结果。根据Genbank数据库中发表的H5和H7亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)核苷酸序列,分别设计合成了H5和H7亚型HA基因特异的引物H5F/R和H7F/R,建立了RT-PCR鉴别H5和H7亚型的分子分型诊断技术。引物H5F/R经RT-PCR能够扩增出H5亚型247bp的目的片段,引物H7F/R经RT-PCR能够扩增出H7亚型192bp的目的片段,这两对引物对其它亚型流感病毒和新城疫、传染性支气管炎病毒RT-PCR检测结果均呈阴性。采用地高辛标记的HA基因探针进行斑点杂交,结果证明了上述PCR产物的特异性。RT-PCR对H5和H7亚型实验感染鸡病料的检测结果与病毒分离结果分别为H5,32/38、30/38;H7,19/38、21/38的符合率为95%。使用引物H5FS/RS或H7FS/RS,经RT-PCR分别扩增出H5亚型998bp或H7亚型712bp的包含裂解位点在内的HA基因片段,目的片段回收后直接用于测序反应,根据核甘酸序列推出的蛋白质氨基酸序列可以用来判定H5或H7亚型病毒的致病性高低,从而为H5或H7型禽流感的毒力分析预测提供可靠的实验依据。分别设计了HA基因和NA基因特异的引物,引物5’端分别添加有BamHI位点和HindIII位点,经RT-PCR分别扩增了禽流感病毒A/Goose/Guandong/1/96(H5N1)1.7kb的HA基因和1.4kb的NA基因,BamHI和HindIII酶切,然后分别克隆到pUC19的BamHI位点和HindIII位点,酶切筛选得到阳性重组子pUCH5和pUCN1。经序列测定后,再将HA基因和NA基因分别亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB的BamHI位点和HindIII位点中,随机筛选得刘 明HS和 H7亚型禽流感病毒分子防制技术的研究2000年 6月别亚克隆到杆状病毒转移载体PBlueBacHisB的BalnHI位点和Hindlll位点中,随机筛选得到重组转移载体pBacHS和pBacNI,序列分析证实读框正确后用于转染实验。从含有A/African Starling/Ensland/983/79(H7NI)HA基冈的重组质粒pUCH7中用 BamH切下1.7kb的M基因,然后将其插入杆状病毒转座载体pFaslBacDUAL的 BalnHI位点,随机筛选酶切鉴定得到止向重组转座于pFASTll7,经序列分析证明HA基因完整,方向正确,然后转染含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac,经抗生素筛选,PCR鉴定得到阳性穿梭转座子rBacmidH7。在脂质体转染试剂CeellFECTIN介导下,将杆状病毒转移载体pBacHS和pBacNI与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-Blue DNA)共转染对数生长期的肝 昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经二轮蚀斑纯化,获得重组杆状病毒rBacHS和rBacNI。重组穿梭载体pBacmidH7在脂质体转染试剂介导卜.转染肝 细胞,获得重组杆状病毒rBacll7。提取重组杆状病毒DNA经PCR扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、ELISA试验结果表明 HA和 NA基因在重组杆状病毒感染的蚊 细胞获得表达。SDS-PAGE电泳分析显示用组杆状病毒表达HA蛋白分子量为60kDa左右,能够凝集公鸡红细胞,血凝价1280—2560HAU/ml。里组杆状病毒表达M蛋白分子量为 50kDa左右。页织杆状病毒rBacHS、rBacNI、rBacH7和野生病毒AcMNPV分别感染肚 细胞72小时后收集细胞,免疫6组6周龄肝P鸡。卜4组,m只/组,m‘细胞/只肌肉注射;对照组1fU 2,5只/组 10‘细胞/只肌肉注射。rBacHS和 rBacH7,rBacNI免疫组经二次免疫后,每次间隔时间为2周,rBacHS和rBacNI联合免疫组1&免疫后4周;分别以10’EID。。的A/Goose,/G。angdong/1/96(HSNI)和A/African Starling/England/983/79(H7N)肌肉接种 10’EIDS。进行攻毒试验,试验结果表明所有亚单位疫苗免疫组都可产生禽流感病毒亚型特异性抗体,rBacHS一次免疫即可诱导产生血撤抑制抗体(HI) 3.slooZ,加强免疫后HI抗体效价明显升高 4.slogZ。rBacHS二次兔疫组和 rBacHS+rBacNI联合免疫组对强毒攻击的保护率达 90%(9/10),rBdCNI免疫组对强毒攻击保护率为 50%(5/10),而空白对照组对强毒攻击不能提供保护,5只鸡全……   
[关键词]:禽流感;核蛋白;RT-PCR;诊断;杆状病毒表达;血凝素;神经氨酸酶;疫苗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2000年