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牛、羊FSHR基因5'端转录启动调控区和部分结构区序列的研究

魏伍川

  通过提高牛、羊的双胎率来降低生产成本,提高经济效益和增加畜产品产出一直是人们期望的目标。因而从遗传结构和基因表达水平上探索提高家畜产仔率的主效基因已在国内外引起广泛重视。FSH是促进卵巢卵泡生长、发育、分化、成熟和排卵的必不可少的重要激素。但其生物学功能的发挥必须经由位于靶细胞膜上的自身受体FSHR的介导将信息传递到靶细胞内。研究发现:多胎绵羊具有对促性腺激素更敏感的卵巢反应性似乎是其与单胎品种的特征性差异之一,对牛、羊多胎性的选择会提高卵巢对促性腺激素反应的敏感性。表明FSH对卵泡发育的作用受到了FSHR表达水平或结构与活性变化的调控。因此,本研究将FSHR基因,尤其是它的5 端转录启动调控区作为对象,研究它的遗传结构和种间变异特征,揭示该基因在产仔率不同的牛、羊种间变异的特点,探讨其在家畜多胎中的作用。首先,借助己报导的澳洲绵羊FSHR基因5 端序列作为引物设计模板,设计PCR引物来扩增分属不同种属的小尾寒羊、关中奶山羊、中国西门塔尔牛和牦牛的FSHR基因5 端转录启动调控区序列。为了保证能扩增出不同种属牛、羊的同源目的DNA片段,引物应用上采用设计和使用多对引物方法,共设计和使用了3对引物;扩增条件上采用通过调整退火温度和对PCR条件进行优化,以保证扩增的成功、稳定和产物的丰度。实验结果表明:使用己知DNA序列作引物设计板模,在同源序列碱基变异率不大于6.1%的条件下,通过设计和使用多对引物可保证能扩增出不同物种的同源单拷贝基因片段。扩增小尾寒羊、关中奶山羊、中国西门塔尔牛和牦牛的FSHR基因结构区第10外显子部分序列,应用己发表的牛和绵羊FSHR cDNA序列为模板,搜寻完全保守的最佳引物序列。对小尾寒羊、关中奶山羊、中国西门塔尔牛和牦牛的扩增产物采用g1assmilk作吸附剂从琼脂糖凝胶中回收;载体加T方法与回收目的DNA连接构建重组DNA。对测定序列应用SEQNCE软件对准、比较和进行扫描,发现小尾寒羊、关中奶山羊和中国西门塔尔牛及牦牛的FSHR基因5’端扩增区域长度有差异,分别为815hP、817hP和slsbP。在基因结构区第1外显子和第10外显子测定序列部分,4畜种的长度完全一致。对4畜种FSHR基因5’端转录启动调控区的研究发现:在转录启动元件类型上,它们的遗传结构与人和鼠的FSHR基因存在重大差别。牛、羊的转录启动区具有TATA型看家基因启动子特征。在它们的序列上,存在一个T们A框,一个类mn序列,多个类m肌序列和一个“框;而在转录起始点邻近无富啼咳区或类InR序列,牛和牦牛还缺失E十ox。在测定的5’端mA序列上,畜种间碱基变异率的高低在-l-50和-251~440位点间两区段存在特征性差异。在前一区段,奶山羊与牛的序列相似性高(96%),而寒羊的碱基变异率较大(10%和14%):在后一区段,牛与寒羊、奶山羊与寒羊的碱基变异率较低门。7们,而奶山羊与牛的碱基变异率高!倍(7.4%)。使用Pstl、Tagl和Haem三种限制性内切酶对5’端区进行PCR-RELP多态性分析,Tagl酶切检测出两种等位基因A和B(Taal在扩增的FSHR基因5’端-527~52’位点和-378~38’位点各有1个酶切位点,定义为等位基因A:只有-527——524一个酶切位点定义为等位基因B)和三种基因型AA、AB和m、畜种间序列的比较显示,等位基因B的出现是由于位于FSHR基因{87-384位点的Tagl酶切序列发生碱基突变,极可能是亿85位点的G突变为A,导致Tagl酶切序列消失造成的。这一突变位点位于畜种间碱基变异率有特征性差异的-251——440位点间区段。小尾寒羊、奶山羊在该突变位点的相应位置均为等位基因B型。对中国西门塔尔牛双胎母牛、种用公牛和随机牛三种不同类型牛及延边牛、南阳牛三个不同品种牛的基因频率和基因型频率分析表明:等位基因B对牛的繁殖、产犊能力有提高作用;等位基因A、B间可能存在有利于牛繁殖、产犊力的正交互作用。这一结果不仅证实了FSHR基因5’端区发生碱基突变会对家畜的繁殖力造成影响,而且证实了-251一440位点间序列对基因转录的抑制作用。对测定的FSHR基因5’端区,应用基因转录启动和调控元件序列进行扫描,共检索出23个转录启动、调控元件或特征性序列。其中在8个转录启动元件序列和7个调控元件序列或特征性序列位点,4个畜种的碱基序列完全一致,在其余8个元件序列或特征性序列上,牛与牦牛失。一2一去了1个GC-ox,3个3’HalfERE和1个甲基化位点反序列;与小尾寒羊相比,奶山羊多出 1个3’half ERE,l个E-box;在发生碱基变异的元件序列位点,小尾寒羊序列的保守性较强,牛和牦牛的碱基变异数多于寒羊和奶山羊,发生碱基变异的调控元件或特征性序列数目也较多。寒羊、奶山羊和牛在转录调控元件(或特征性序列)数目,调控元件碱……   
[关键词]:FSHR;5’端转录启动调控区;转录启动元件;调控元件;特征性差异;特征序列;碱基变异
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2000年