手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的高效表达

熊绍虎

  目的:克隆人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)完整成熟肽基因,并在大肠杆菌中高效表达,获得具有生物活性的重组人BMP-2。方法:①依据Genbank中hBMP-2的序列合成两条引物,从人胎儿骨组织中提取的总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到hBMP-2完整成熟肽基因。将所得的基因片段插入克隆载体pUC-19中,克隆并测序。②设计出5 端突变引物,通过PCR的方法,将hBMP-2基因5 端突变为E.Coli所偏好的密码子,以利于其在E.Coli中的表达。将突变的hBMP-2基因插入表达载体pBV220中,转化E.Coli BL21,温度诱导,并探讨不同活化时间与诱导时间对表达的影响。③将表达所得包涵体,经DEAE阴离子交换层析和S-300分子筛凝胶过滤纯化,体外复性获得rhBMP-2,用小鼠肌袋模型测活。结果:①测序结果显示所克隆基因与Genbank上完全一致,预想突变位点已突变。②重组质粒pYR(pBV220-hBMP-2 )经限制性核酸内切酶酶切分析表明:突变的hBMP-2基因成功插入表达载体pBV220中,转化E.Coli BL21后温度诱导,最佳的活化状态为OD_(600nm)≈0.45,最佳诱导时间为4h。表达量达30%。③重组hBMP-2经纯化后纯度达95%以上,4周后见小鼠肌肉内有新生骨生长。结论:①克隆了hBMP-2完整成熟肽基因并成功将hBMP-2基因的5 端突变为E.Coli所偏好的密码子。②重组hBMP-2表达载体pYR在E.Coli BL21温度诱导表达,所得重组蛋白具有较理想的成骨活性。……   
[关键词]:人骨形态发生蛋白-2;聚合酶链式反应;克隆;表达;纯化;活性鉴定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第一军医大学2000年