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人胰岛素样生长因子1基因的克隆、表达及产物纯化与检定

吴岚晓

  胰岛素样生长因子1(IGF-1)是一种多功能细胞调控因子,大量实验表明,IGF-1生物学作用广泛,对多种组织器官有生物学作用。目前,人IGF-1(hIGF-1)制剂在临床上已用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合症、侏儒症及神经系统疾病等多种顽疾,取得较好的临床效果,显示出良好的应用前景。为获得大量纯度高的、具有生物学活性的hIGF-1以满足基础研究与临床应用的需要,本文应用基因工程方法,将hIGF-1基因与原核表达载体pRSET B进行重组,在大肠杆菌中进行了表达,并对其分离纯化及性质检定方法进行了探讨。首先,根据已知天然hIGF-1编码基因序列,在不改变氨基酸序列的条件下,人工设计合成了适合于在大肠杆菌中表达的hIGF-1基因并克隆于pUC19中,构建了pUCIGF克隆载体。设计引物,导入合适的酶切位点,以pUCIGF为模板,PCR扩增目的基因,经适当酶切后,克隆于原核表达载体pRSET B中,构建了pRSET-IGF表达重组质粒,经PCR筛选、酶切鉴定和核苷酸序列测定,确定重组质粒pRSET-IGF构建完全正确。将重组质粒pRSET-IGF转化宿主菌BL21,工程菌发酵经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析表明,可表达分子量约为7.8kDa的重组蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的10-20%。发酵后,菌体采用超声破菌,目的蛋白以可溶性形式存在于裂解液上清中,上清经阴离子交换,疏水层析及分子筛纯化后,经SDS-PAGE电泳检测,纯度达98%以上,HPLC分子筛测定纯度为91.4%。蛋白印迹分析显示,此纯化蛋白能与抗hIGF-1抗体发生特异性反应,表明此表达产物具有hIGF-1抗原活性,重组蛋白良好的促NIH3T_3细胞增殖效应,显示重组hIGFI(rhIGFI)具有一定的生物学活性。上述结果表明,人工合成hIGF-l基因能在大肠杆菌中以可溶性形式获得高效表达,经纯化后获得有生物学活性的rhIGF纯品,为获得大量基因工程产品以满足进一步研究与临床应用奠定了基础。……   
[关键词]:重组人胰岛素样生长因子1;克隆;表达;纯化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第一军医大学2000年