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副溶血性弧菌直接溶血毒素基因的克隆、突变研究

吴振龙

  副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)为一种嗜盐性弧菌,能导致人类食物中毒和旅游者腹泻,还能导致反应性关节炎、心脏疾病等。而临床上检测到的致病茵大多具有溶血现象(亦称神奈川现象),基因水平研究发现该类病原体都携带tdh基因,编码TDH。本研究应用基因工程技术克隆了tdh基因,并让其在原核表达载体pTrc99A上、经IPTG诱导得到高效表达,获得重组抗原,制备抗-TDH抗体;突变了TDH的Trp65→Ala65,期望构建出针对TDH的基因工程疫苗候选株。设计一对引物,采用PCR技术扩增tdh基因,用限制性内切酶消化tdh、pUC19和pTrc99A,连接并转化宿主菌JM109,筛选并鉴定出重组质粒tdh/pUC19,由军事医学科学院完成序列测定。再亚克隆至pTrc99A上,构建出重组质粒tdh/pTrc99A。发酵重组菌tdh/pTrc99A/JM109,条件优化后,tdh基因在pTrc99A上,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明tdh基因得到高效、可溶、非融合性表达;溶血试验证明该表达产物具有溶血活性。表达产物经超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换层析得到纯化。将tdh/pTrc99A/JM109作为抗原,经0.4%甲醛灭活,腹腔免疫大白兔,免疫程序为第1天、第5天、第9天、第11天和第15天,免疫剂量分别为12亿、12亿、18亿、18亿、18亿。末次免疫后第7天试血,效果满意后放血。兔血清经宿主菌JM109吸附,溶血抑制试验提示兔血清含有抑制VP溶血活性的物质。设计一个诱变引物,与扩增tdh基因的上游引物,构成一对诱变引物,采用寡核苷酸定点突变的方法,定点突变编码TDH的第65位氨基酸的核苷酸残基(由野生型的Trp残基突变为Ala残基),通过基因工程技术,构建出Ala65的重组质粒tdhm/pUC19(tdh mutation),由中山医科大学达安基因诊断中心完成序列测定。再亚克隆至PTrc99上,构建出重组质粒tdhm/pTrc99A。发酵重组菌tdhm/pTrc99A/JM109,条件优化后,tdhm基因在pTrc99A上、经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明tdhm基因也得到高效、可溶、非融合表达。测试溶血毒力,发现突变体的溶血毒力小于野生株。……   
[关键词]:副溶血性弧菌;直接溶血毒素;克隆;突变
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第一军医大学2000年