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营养相关基因(fdr3和TaNRT1)功能的进一步研究

白彦霞

  Ⅰ 玉米缺铁相关基因fdr3的western与Southern blottingfdr3是由缺铁诱导的玉米根cDNA文库经差示筛选得到的阳性克隆之一。用IPTG诱导含有fdr3重组质粒的E.coli菌株,其表达产物经SDS-PAGE分离后与铁相关抗血清进行western blotting,结果有一杂交区带。缺铁胁迫处理的玉米根可溶性蛋白经与同一抗血清进行western blotting,在40kD左右出现一杂交区带。对fdr3进行DNA序列分析,发现其中有一个1068bp的开放读框(ORF),这可能与western blotting检验的40kD蛋白区带在分子量上具有相关性。在GenBank中的同源性分析表明它是一未知基因。其编码氨基酸序列的疏水性分析表明其中含有几个疏水结构域,表现出完整功能蛋白的结构特点。从fdr3的1068bp的ORF中切下约800bp的片段,作为探针,分别与玉米、小麦、烟草和衣藻的基因组DNA进行Southern blotting,结果在玉米、小麦和衣藻中都有明显的杂交信号,而在烟草中未出现信号,推测此片段可能不是双子叶植物烟草基因组DNA的成分。Ⅱ 小麦NO_3~--transporter基因片段的克隆与pGEX-2T-TaNRT1融合蛋白基因的构建在前人实验的基础上,为了进一步研究小麦的高亲和力NO_3-transporter基因TaNRT1(AF fragment),把从小麦根总RNA中,通过RT-PCR获得的高亲和力NO_3-transporter基因片段与pBluescript-T质粒载体连接重组。经过克隆筛选、酶切和测序分析,表明所构建筛选的重组体正确,其外源片段为657bp左右,并修正了前期PCR产物的AF片段的多处N碱基。接着,又从T-vector上切下构建到系列表达载体pGEX-1,2T,3X上,经酶切及测序分析(只有pGEX-2T-TaNRT1测序了)表明构建的重组体结构正确。用IPTG对系列表达重组体(三个)进行诱导表达,经电泳分析,其中pGEX2-2T-TaNRT1表达产物分子量偏小,未发现预期的52kD左右的融合蛋白区带,现正进一步调整诱导条件,以期得到表达正确的融合蛋白。……   
[关键词]:缺铁胁迫基因;蛋白质印迹;Southern印迹;NO_3-transporter基因;融合蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:首都师范大学2000年
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