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苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因克隆及表达的研究

郭巍

  本研究在PCR-RFLP方法的基础上,采取部分酶切质粒DNA建立质粒文库以及通过Southern杂交的克隆策略,分别克隆了cry2Aa8、cry2Aa9基因,构建了含有cry2Aa8基因的Bt工程菌BiotⅡ20、BiotⅡ176和BiotⅡ732,进行了BiotⅡ176杀虫活性的测定。1B-G-8及Bt66菌株中cry2Aa基因的克隆对东北农业大学提供的B-G-8菌株质粒DNA用Sau3AI部分酶切,回收4-7kb酶切片段,与BamHI酶切的克隆载体pUCP19连接,构建了重组质粒文库。通过PCR鉴定、筛选,克隆了4.5kb含cry2Aa全长基因的片段,并完成了亚克隆和全序列测定。编码区全长1902bps,编码633个氨基酸的晶体蛋白,分子量为70.853kDa,等电点pHi8.185,属弱碱性蛋白。该基因已在EMBL、GenBank中登记,Accession Number为AJ273218,并提交国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会,被正式命名为cry2Aa9。鉴定发现,Bt66菌株含有cry1Ea及cry2Aa两种基因。以PCR扩增产物为探针,对Bt66菌株质粒完全酶切产物进行Southern杂交,结果表明该基因定位于质粒DNAHindⅢ酶切的5.0kb片段上。将此片段克隆到pBluescriptSK(+)HindⅢ位点,并转化大肠杆菌JM107。PCR及限制性酶切分析结果表明,5.0kb阳性片段含有cry2Aa基因。以此结果克隆了cry2Aa基因,并获得了4.0kb的亚克隆。核酸序列分析及氨基酸同源性比较,在该基因编码区第795位碱基与已知的cry2Aa1、2、3基因存在差异,由A变为G,其编码的氨基酸也由丝氨酸(Ser)变为甘氨酸(Gly),表明Bt66菌株中的cry2Aa基因是一种新基因。该基因编码区为1902bps,编码633个氨基酸的晶体蛋白,分子量为70.821kDa,等电点为pHi8.185,属弱碱性蛋白。该基因已在EMBL、GenBank中登记,Accession Number为AJ252262,并提交国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会,被正式命名为cry2Aa8。2cry2Aa基因的表达及工程菌的构建将cry2Aa8、cry2Aa9全长基因分别克隆于pGM1105和pHT315多克隆位点上,分别获得表达载体pGW1105(Bt-E.coli-Pf穿梭)和pZG315(Bt-E.coli穿梭)。电击转化Bt无晶体突变株BE20、Bt自然菌株UV17、HD-73,构建了BiotⅡ20、BiotⅡ176和BiotⅡ732三种Bt工程菌。PCR可检测到cry2Aa基因的存在。经光镜观察,发现工程菌BiotⅡ176及BiotⅡ732中既有Cry2Aa8的方形晶体,又有Cry1Ba和Cry1Ac的菱形晶体存在。SDS-PAGE电泳表明,BiotⅡ176和BiotⅡ732中均能表达70kDa蛋白。证明cry2Aa8基因在UV17和HD-73中能正常表达。cry2Aa8基因在无晶体突变株BE20中表达不稳定。将pGW1105转化荧光假单胞菌P303,经PCR及DNA酶切检测证明转化成功。生长曲线测定表明,外源基因cry2Aa的导入对受体菌UV17和HD-73的生长速率无影响。3工程菌室内杀虫活性测定测定双价基因工程菌BiotⅡ176(cry2Aa+cry1Ba)对小菜蛾幼虫活性,以单一基因自然菌株UV17(cry1Ba)作阳性对照,结果表明,BiotⅡ176杀虫效果高于UV17,二者表现协同增效作用。……   
[关键词]:苏云金芽孢杆菌;cry2Aa;基因克隆及表达;工程菌;杀虫活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2000年