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华北落叶松体细胞胚胎发生与遗传转化系统建立的研究

齐力旺

  以成龄华北落叶松子叶期前的未成熟胚为外植体进行体细胞胚胎发生的研究,在胚性愈伤组织诱导培养阶段、体细胞胚成熟培养阶段,运用311-A最优回归设计方法研究培养基中激素主效应与互作效应值,筛选落叶松体细胞胚胎发生过程中诱导培养基、增殖培养基、成熟培养基、萌发培养基并进行目的基因的遗传转化实验研究。在继代、增殖培养中研究了含有NAA与2,4—D的培养基对形成早期原胚以及体细胞胚进一步发育、生根的影响;同时,探索在成熟培养基中用麦芽糖代替蔗糖,对体细胞胚成熟及生根的影响。针对研究中出现的不同类型胚性愈伤组织内体细胞胚胎发生频率与体细胞胚质量不同的特点,收集10种不同类型的胚性与非胚性愈伤组织,研究某些生理生化方面的差异,从而有利于调控培养基组成与浓度及落叶松体细胞胚胎发生过程。此外,以B.t基因和lp3基因为目的基因用基因枪进行遗传转化,检测华北落叶松体细胞胚胎发生遗传转化实验系统。结果表明:落叶松体细胞胚胎发生过程中,诱导胚性愈伤组织发生的基本培养基为S,增殖培养基为S+B,萌发培养基用WPM优于S+B培养基,体细胞胚后侧根诱导与嫩梢伸长以B_5培养基好。球果采集时间与胚性愈伤组织的发生密切相关,6月6日采集的外植体,胚性愈伤组织诱导频率为零,6月30日采集的外植体,胚性愈伤组织诱导频率2~#树为13.75%、3~#树为18.8%。利用311—A最优回归设计,进一步剖析影响落叶松胚性愈伤组织发生的主导因子,发现主导因子 2,4—D、BA与 KT的最佳组合浓度依次为 1.29mg/L、0.39mg/L和 0.58m/L,由此组合的 S培养基上,起始培养 36天后,落叶松胚性愈伤组织的诱导量可达到13.93mg/个.外植体,根据实验结果建立了2.4-D、BA、Kf各因子与落叶松胚性愈伤组织诱导量的多项式回归方程为:y=1.1246+5.9344x_1+23.3774x_2+22.7825x_3一 2.5755x_1x_2 +l.4763x_1x_3一 10.1607x_2x_3一 2.2311x_1~2一 17.9371x_2~2一 17.83561x_3~2(R~2=0.9849)。据此方程进行了主导因于的主效应和互作效应值分析。增殖培养基中用NAA代替2,4—D进行增殖培养,有利于诱导高质量的体细胞胚。如培养基中含有 0.5mg/L NAA代替 0.11mg/L 2,4—D继代两次后,明显改善早期原胚的质量,将该类胚性愈伤组织转接于成熟培养基上,比一直继代于含有2,4—D培养基上愈伤组织发生的体细胞胚,其胚后的发育更好。经研究改良成熟培养基上发现:在3%麦芽糖代替蔗糖配合4%的PEG4000和0.1%活性炭的成熟培养基上,体细胞胚成熟频率可达106.7个/克愈伤组织,明显地改善体细胞胚的质量,下胚轴较长、不膨大、于叶舒展,生根率达57.89%,根系正常。同时,针对常出现的畸形胚、体细胞胚发生频率低、成熟频率低等问VI题,进一步剖析体细胞胚发生数量的主导因子--ABA、PEG4000、AgNO3的主效应和互作效应,利用 311—A最优回归设计,求出最佳组合方案为:ABA 18.91mglL、PEG400088.8019/L、AgNO。10.75mglL,该组合的S十B培养基上,落叶松体细胞胚发生频率可达到107.5个l克.愈伤组织,依据实验结果建立了ABA、PEG4000、AgNO3与落叶松体细胞胚发生数量的多项式回归方程为:y目7.0175+2.4348XI+1.2310X2十4·2465X3十0·0010XIX2+0.0415X;X。+*.0432X。X。一*.0785X;‘一。0097Xz‘一0.4122X。‘欠d.9885),进而分析了主导因子的主效应和互作效应。鉴于落叶松胚性愈伤组织在增殖过程中出现的形态、结构、颜色等特征的变化以及不同类型愈伤组织的体细胞胚发生频率的差异,我们对不同类型的胚性与非胚愈伤组织,包括:不同基因型(2”、3“)、同一基因型不同细胞系(ZA、ZI)以及经ABA处理等多种不同类型的胚性与非胚性愈伤组织,进行了生理生化差异的分析,测定了愈伤组织内氨基酸、糖类、酚酸、激素以及离子的含量;研究发现,非胚性愈伤组织中18种游离虱基酸含量显著高于胚性愈伤组织,尤其是精素酸、赖氨酸、缀氨酸的含量,非胚性是胚性愈伤组织的3—4倍;三糖、多糖的含量胚性与非胚性愈伤组织内差异不大;而经ABA处理后的胚性愈伤组织内多糖与邻苯二酚含量急剧上升,多糖是未处理的18倍,三糖含量与不同基因型密切相关;非胚性愈伤组织中乙烯释放量高于胚性胚性愈伤组织;同时发现金属离子中 C/的含量,胚性愈伤组织是非胚性的 12倍,胚性愈伤组织中 NH4”与 NO/的比值是非胚性愈伤组织中的10倍以上,实验结果为进一步调控培养基、探索针叶树体细胞胚胎发生的生理生化机理提供依据。在此基础上,取增殖培养较好而适合于轰击的胚性愈伤组织,利用基因枪将Bt基因转化入落叶松愈伤组织。之后,又将巾3基因转化入落叶松,发现钨粉用量、被轰击材料的状况以及轰击强度等直接影响转化效果。基因枪轰击lp3基因后,愈伤组织细胞损伤严重,……   
[关键词]:华北落叶松;体细胞胚;胚性愈伤组织;细胞团;311—A;最优回归设计;麦芽糖;PEG4000;S+B;lp3基因;遗传转化;基因枪;主效应;互作效应
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国林业科学研究院2000年