手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

锌镉超积累植物东南景天SaPCR1和SaPCR2基因的克隆及功能分析

高晓宇

  植物修复作为一种效果好、耗费低的重金属污染土壤修复手段,具有良好的发展前景。超积累植物因其对重金属极强的提取能力,被认为是良好的植物修复材料。东南景天是一种锌/镉超积累植物。研究东南景天的超积累及超耐性机制不仅为我国重金属污染的植物修复技术优化提供理论基础,同时也丰富和拓宽了我们对植物适应重金属逆境胁迫的适应性机制的认识。目前,有关东南景天超积累重金属的生理生化机制已有不少研究,也陆续开展了一些分子生物学层面的研究,包括转录组测序,重金属转运相关基因的克隆及其相关功能的研究。然而,我们对东南景天超积累重金属的分子机理的认识还远远不够。本研究取得的主要研究结果如下:1.首先,我们克隆到了两个东南景天PCR家族的基因(SaPCR1、SaPCR2),并对其序列及对重金属的转运功能进行了分析。通过进化树比较发现SaPCR1、SaPCR2与ARPCR1、ARPCR2、ARPCR3亲缘关系最近,且SaPCR1、SaPCR2含有CCXXXXCPC结构,这种半胱氨酸丰富域在PCR家族中高度保守且被报道与植物体内镉的解毒机制有一定的关系。从相对定量的结果来看,SaPCR1、SaPCR2基因在超积累生态型东南景天中的表达量均显著高于非超积累生态型中的表达量,其中SaPCR1在各个部位均有表达,在根部表达量最高,茎次之,叶片中的表达量最低,SaPCR2主要在根系中表达,在地上部基本不表达,这说明上述基因尤其是SaPCR2主要在根系中起调控作用。烟草叶片亚细胞定位证实SaPCR1和SaPCR2均定位在细胞膜上。此外,将SaPCR1、SaPCR2蛋白在Zn/Cd敏感型酵母中表达发现,SaPCR1和SaPCR2的转入均提高了酵母对镉的耐性,酵母体内镉含量也显著下降,但是对锌却没有明显的作用。将SaPCR1、SaPCR2在拟南芥中过表达后发现,过表达SaPCR1的拟南芥与野生型相比,在镉处理条件下,根系中的镉含量显著提高,但是据此并不能明确SaPCR1的功能。过表达SaPCR2的拟南芥与野生型相比根系镉含量显著降低。上述结果暗示SaPCR2的主要功能是介导超积累东南景天根细胞中镉由胞内向胞外的转运过程。2.在构建非超积累东南景天转基因体系基础上,进一步分析了SaPCR2在东南景天体内镉跨膜运输中的作用。首先,我们分别选取了带有一个腋芽的1-2cm成熟茎、幼嫩茎段和种子来培养东南景天无菌材料,结果发现种子苗的生长状况最好,且变异小,易于获得,是构建转基因体系良好的材料。由于东南景天在无菌培养过程中自身的变异性大,易畸变,我们选用了初代培养的种子苗幼茎为材料进行转基因试验,并通过激素浓度筛选试验获得了非超积累东南景天组织培养体系。组织培养及转基因体系适宜的培养基和激素浓度配比参数如下:愈伤组织诱导培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D,愈伤组织分化培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA,生根培养基为1/2 MS。通过上诉构建的非超积累东南景天转基因体系,我们成功获得了SaPCR 过表达株系,并分析了SaPCR2过表达对非超积累东南景天吸收镉的影响。结果表明,在镉处理条件下,与非超积累东南景天相比,转基因株系根系镉含量显著降低,而茎叶则没有显著变化。这一结果与拟南芥的结果相似,SaPCR2在非超积累东南景天中过表达可能促进了转基因株系镉在根部的外排。上述结果进一步证实了SaPCR 在超积累东南景天根系高量表达,促进了根细胞内镉的外排过程,从而缓解了镉胁迫对植株根系的影响,提高了东南景天对镉的耐性,也为后续构建超积累东南景天转基因体系提供经验。……   
[关键词]:东南景天;;SaPCR1;SaPCR2;转基因体系;分子机制
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2018年
App内打开