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柑橘黄化脉明病毒诱导尤力克柠檬细胞程序性死亡研究

邓雨青

  柑橘黄脉病是柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起的一种新型柑橘病害,严重威胁柠檬和酸橙产业,主要造成叶片脉明和黄化。目前该病在我国重庆、四川等地相继爆发,尤其以四川安岳柠檬产区为害最为严重。研究发现细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)与植物抗病过程密切相关。植物抵抗病原物入侵时产生的过敏性反应(hypersensitive reaction,HR)是植物抗病的的重要手段之一,也是PCD的一种表现。本研究以健康尤力克柠檬为试材,采用嫁接传毒的方法,通过对CYVCV侵染后不同时期尤力克柠檬病毒含量、PCD相关基因、代谢酶活性进行测定,并结合TUNEL原位末端标记、电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳等方法对PCD进行检测,从而了解CYVCV诱导柑橘细胞程序性死亡机制。主要研究结果如下:1、通过DTBIA与免疫荧光技术确定CYVCV在尤力克柠檬叶片主脉的韧皮部、分泌腔周围以及薄壁细胞中发生。2、TUNEL技术检测结果表明:在感病初期,随着感病时间的增加,尤力克柠檬叶片出现PCD阳性反应,并随着CYVCV含量的增加而不断加强;而在感病后期CYVCV含量降低,PCD阳性反应减少。因此推测CYVCV可以诱导尤力克柠檬PCD的产生,同时PCD阳性反应随CYVCV含量的增加不断增多。3、CYVCV胁迫下,尤力克柠檬根、茎、叶都出现不同程度的PCD阳性反应,由强到弱依次为根、茎、叶,与CYVCV含量分布相一致。因此推测CYVCV含量的增加可以促进尤力克柠檬叶片PCD的产生。4、CYVCV诱导尤力克柠檬叶片超微结构变化:(1)叶绿体淀粉粒增多,嗜锇颗粒增多且体积变大,叶绿体肿胀、畸形,病变严重的叶绿体出现解体现象。(2)少量线粒体出现外膜溶解、嵴突模糊、解体等现象。(3)细胞核出现染色质凝聚且边缘化,核膜溶解,核质高度浓缩等典型PCD现象。进一步证明PCD可以诱导柑橘细胞程序性死亡。5、通过实时荧光定量PCR检测CYVCV胁迫下尤力克柠檬不同时期PCD相关基因CsCysp、Cit-Dad1-1和MCA1的表达,结果显示,CsCysp、Cit-Dad1-1基因表达量下调,MCA1基因表达量上调,从而促进PCD的产生。6、CYVCV侵染后,感病组织caspase-3蛋白酶活性随感病时间的增加而增加;丙二醛含量呈先下降后上升趋势,且高于对照组,表明细胞膜脂过氧化作用增加;感病前期细胞内SOD、CAT、POD酶活性总体呈下降趋势,细胞抗氧化能力减弱,引起ROS积累,从而诱导PCD的产生;感病后期抗氧化酶活性升高,加快活性氧的清除,从而抑制PCD的产生。……   
[关键词]:柑橘黄化脉明病毒;尤力克柠檬;细胞程序性死亡
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2017年