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基于转录组数据的嗜虫书虱P450基因的克隆与表达研究

李婷

  嗜虫书虱Liposcelis entomophila(Enderlein)是一种重要的储藏物害虫,大量发生时可造成严重的经济损失,且对化学药剂的抗性发展迅速,已引起全世界储藏物工作者的高度重视。但与其他储藏物类害虫相比,关于嗜虫书虱抗性机理的研究鲜有报道。细胞色素P450是昆虫体内一种重要的解毒代谢酶,在昆虫的生命活动中具有重要的生理功能。本学位论文以嗜虫书虱为研究对象,围绕细胞色素P450介导昆虫代谢抗性这一科学问题开展研究工作。具体内容包括:测定嗜虫书虱对药剂的敏感性,明确不同种群的抗性水平;构建嗜虫书虱转录组数据库,筛选鉴定具有解毒代谢功能的基因信息;聚焦细胞色素P450基因,克隆cDNA全长序列,解析这些基因在不同性别、不同发育阶段以及药剂诱导后的表达模式;初步构建嗜虫书虱P450基因真核表达载体;从生化水平上比较相对抗性和相对敏感种群P450s的酶学特征。研究结果为探究细胞色素P450是否参与嗜虫书虱抗药性形成提供基础数据,在实践上为制定嗜虫书虱可持续的防控策略提供指导。主要研究结果如下:1嗜虫书虱转录组测序及解毒代谢酶基因的鉴定利用Illumina技术对嗜虫书虱全虫态进行转录组测序,通过组装拼接获得了54,220个Unigene,提交至Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO数据库进行BLASTX比对,得到成功注释的Unigene分别有33,404、25,637、23,068、11,773和19,355个;序列同源性分析结果表明,在Nr数据库中得到注释的Unigene与体虱相关基因同源性最高,达59.93%。GO分析发现,共有19,355个Unigene被划分到生物过程、细胞组分和分子功能3大主要类别的61个功能组中。在COG功能注释中,嗜虫书虱11,773个Unigene被归类到25个COG功能家族中。进一步对嗜虫书虱转录组进行分析,筛选与药剂解毒代谢相关的基因。根据Nr数据库注释,共鉴定得到68个P450 Unigene,平均长度为1,124 bp,其中35个Unigene同CYP3集团亲缘关系最近,18个Unigene属于CYP4集团,有9个和6个Unigene分别与CYP2集团和线粒体集团基因同源性最高;同时,筛选鉴定出37个GSTs Unigene,平均长度为551 bp,分属于Delta、Omega、Sigma、Theta、Zeta以及Microsomal等GSTs家族,其中Delta家族和Sigma家族包含Unigene个数最多,分别为17个和13个。此外,筛选出19个CCEs基因,平均长度为1,427 bp,这些CCEs分为6个分支,Clade A、Clade D、Clade E、Clade F、Clade H和Clade J。2嗜虫书虱5个p450基因的克隆与序列分析基于转录组数据库p450unigene片段信息,通过对cdna全长序列的克隆和测序验证,获得5个嗜虫书虱p450基因包含完整的开放阅读框(orf)的cdna序列,分别命名为cyp358b1(kt071005)、cyp345p1(kt071006)、cyp4fd2(kt071007、)、cyp4cd2(kt071008)和cyp6jn1(kt071009)。上述5个p450基因orf核苷酸长度介于1,500-1,554bp,所编码的氨基酸序列长度范围为499-517aa。通过使用mega5.05软件,应用neighborjoining方法构建系统发育树,明确这些基因与其他物种相应基因的亲缘关系以及潜在的功能,发现这5个p450基因分布在cyp3和cyp4集团,说明其有可能参与解毒代谢过程。3嗜虫书虱p450基因的表达模式解析3.1嗜虫书虱p450基因在不同性别及不同发育阶段的表达模式利用qpcr技术,对嗜虫书虱5个p450具有全长cdna序列的基因和12个基因片段(unigene17618、unigene25300、unigene26646、unigene6837、unigene27020、unigene13178、unigene18998、unigene25537、unigene12385、unigene6029、unigene22015和unigene25076)在不同性别中和不同发育阶段的mrna表达水平进行分析。结果表明,5个p450基因和10个unigene(unigene25300、unigene26646、unigene6837、unigene27020、unigene13178、unigene18998、unigene25537、unigene12385、unigene6029和unigene22015)在雌成虫的表达量均高于雄成虫,相反,其余2个unigene(unigene17618和unigene25076)在雌成虫的表达量显著低于雄成虫。对嗜虫书虱5个p450基因及12个unigene在不同发育阶段的表达模式进行分析,结果显示,17个基因在整个发育阶段均表达,且在成虫期的表达水平高于若虫期或卵期。其中,cyp345p1、cyp4cd2、cyp4cd2、cyp6jn1以及9个unigene(unigene17618、unigene26646、unigene6837、unigene27020、unigene13178、unigene25537、unigene6029、unigene22015和unigene25076)在卵期及若虫期表达量较低,随着若虫羽化为成虫后,mrna表达水平显著增高,说明以上13个基因可能主要在成虫期行使重要的作用。而cyp358b1和unigene25300在卵期的相对表达量较高,推测其与卵期生理活动及适应外界环境有关。3.2嗜虫书虱p450基因对药剂胁迫的响应模式在生物测定基础上,通过不同类型药剂(拟除虫菊酯类、有机磷类和氨基甲酸酯类)对嗜虫书虱进行胁迫,分析p450基因的响应模式。结果发现,嗜虫书虱p450基因对马拉硫磷胁迫的响应最为明显,经药剂诱导后,5个p450基因和5个unigene(unigene26646、unigene13178、unigene18998、unigene12385和unigene25537)在12h达到表达高峰,其中cyp4cd2和cyp6jn1诱导表达上调幅度较大,分别为对照的9.77和9.47倍;24h后,多数基因的表达量又回落至对照组水平,这暗示p450基因对有机磷类杀虫剂反应迅速且剧烈,但在体内的代谢率可能比较缓慢。嗜虫书虱多数p450基因可被溴氰菊酯诱导上调,其表现出的诱导效应相对滞后,表达高峰多出现在药剂处理24h后,其中cyp345p1、cyp4cd2和cyp6jn1的相对表达量在诱导后不同时间段呈现出抛物线的变化趋势,而cyp4fd2在胁迫初期表达受到抑制,随后逐渐升高,在处理36h后达到高峰。此外,unigene25076和unigene22015的表达量在24h后出现一个峰值,而unigene27020、unigene25537、unigene6029、unigene18998和unigene6837在药剂诱导后表达量显著降低。嗜虫书虱p450基因经残杀威诱导后,cyp358b1和cyp6jn1的表达量在残杀威(lc50)诱导后出现一定程度上调,而cyp345p1、cyp4fd2和cyp4cd2基因经残杀威诱导后,其表达先受到一定程度的抑制,随后随着恢复时间延长,基因表达量逐渐上升;unigene17618、unigene25300、unigene26646、unigene13178、unigene18998和unigene12385的表达量在4个时间段内的变化呈抛物线性,unigene6837、unigene25537、unigene6029和unigene22015的表达量变化在诱导后的时间段内呈w型,unigene25076的表达量在受到药剂诱导后显著下调,于24h上调至最大值,随后回落直至低于对照组。3.3嗜虫书虱p450基因在不同种群间的表达模式以随州种群的表达量为基准,其它种群相对表达量与之比较,发现5个基因在铜梁种群的表达丰度均显著高于该基因在随州种群的表达量,分别是在随州种群中表达量的3.84、2.08、4.38、8.03和13.13倍。其中cyp345p1和cyp4cd2在海南种群的表达量也相对较高,与随州种群相比,分别约为5.00和6.37倍。4嗜虫书虱抗性和敏感种群p450酶活性比较对实验室现有的嗜虫书虱不同种群进行药剂(溴氰菊酯、马拉硫磷和残杀威)敏感性测定发现,随州种群对所测药剂相对敏感,而铜梁种群抗性水平相对较高。据此,分析这2个种群p450酶活性的差异。结果表明,相对抗性种群的p450酶活性高于相对敏感种群,二者相差1.93倍。经药剂胁迫后,p450s活性均呈现不同程度上升。其中,马拉硫磷处理后p450s的活性是对照的2.97倍,且差异显著;溴氰菊酯处理后p450s活性是对照的2.35倍。上述结果暗示细胞色素p450可能参与介导嗜虫书虱抗性的形成,推测细胞色素P450能对不同类型的杀虫剂产生代谢作用。5嗜虫书虱P450基因真核表达载体构建选取嗜虫书虱在药剂处理后mRNA相对表达量显著变化的CYP4FD2为对象,采用双酶切及DNA重组技术成功构建了CYP4FD2基因的杆状病毒表达载体。基于昆虫杆状病毒表达系统构建嗜虫书虱P450基因真核表达载体,为后续书虱P450基因的异源表达和功能分析奠定了基础。……   
[关键词]:嗜虫书虱;细胞色素;P450;酶系;转录组;药剂诱导;表达模式;真核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2016年