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植物病毒病害人工miRNA自动应答防治技术

周汉琛

  植物病毒病常导致植物生长发育异常,严重时可导致植物的死亡,威胁着农业生产。近年来,利用人工miRNA (artificial microRNA, amiRNA)防治植物病毒病的技术研究,已经取得许多重要成果。人工miRNA技术主要是利用天然miRNA能够降解目标靶基因的特性,构建能够降解病毒基因的amiRNA,从而达到控制病毒病的效果。这些研究在构建人工miRNA载体时使用的启动子大多为组成型强启动子,不仅增加了受体植物的基因表达负荷,还常导致植物内源miRNA的加工系统的饱和,影响受体植物生长发育。所以,要建立高效的植物抗病体系,需要进一步探明植物和病毒互作的分子机理。因此,本实验以模式植物烟草及其三种RNA病毒为试材,研究在病毒侵染过程中,烟草基因的表达变化,试图找到被病毒特异诱导的启动子。与此同时,对烟草天然miRNA的功能进行验证。旨在研究在病毒特异诱导的启动子下,以烟草中的天然miRNA为骨架构建的amiRNA防治病毒病的效果,为植物病毒病防治研究提供理论依据。本实验利用3种RNA病毒(烟草花叶病毒,Tobacco mosaic virus, TMV;黄瓜花叶病毒,Cucumber mosaic virus, CMV和马铃薯Y型病毒,Potato virus Y, PVY)、2种非生物逆境(4℃,150 mM NaCl)和2种逆境信号物质(1 mM茉莉酸,methyl jasmonic acid, MeJA和1mM水杨酸,salicylic acid, SA)处理普通烟草,定量分析可能受病毒诱导的10个烟草基因表达量的变化,试图找到受病毒高效诱导的烟草基因。定量结果发现,在3种RNA病毒接种下和SA处理后,候选基因06G表达水平显著升高,但在其它逆境处理下表达变化不显著。进一步分析TMV侵染后不同时间段06G表达水平的变化,结果显示,06G表达水平能够被快速激活,接种6h后,06G表达水平即能达到对照的500倍,而且这种高水平的表达能够一直维持20 d。通过以上结论我们推测候选基因06G的启动子受病毒特异诱导。利用染色体步移技术克隆了06G转录起始位点上游的1967bp序列,并通过在线分析软件PLANTPAN找到与病理相关的转录因子结合位点WBOXATNPR1。实验中将06G启动子连接报告基因GUS,分别为06GP1215:GUS和06GP1967:GUS,分段研究06G启动子功能。结果显示06GP1215:GUS在瞬时表达和稳定表达实验中,在1mMSA作用下GUS表达水平比对照升高20倍。但是,染色分析未检测到GUS产物形成的蓝色斑点。06GP1967:GUS瞬时表达结果显示,在未经SA处理的GUS表达水平为对照的40倍,而在1mM SA处理下导致基因表达升高200倍。且在染色分析GUS在瞬时表达和稳定表达中的活性实验时,都有大片的蓝色区域生成。实验说明,06G的1215bp长度的启动子序列不具有完整的功能,只能微弱启动GUS的表达,而06G的1967bp长度的启动子序列具有显著的功能,并可以在SA处理下驱动报告基因GUS的高量表达,与前面的定量分析实验结果相映。综上所述,推测06GP1967启动子受病毒诱导启动。为了获得构建烟草病毒自动应答体系,需要获得具有正常功能的烟草天然miRNA。本研究通过生物信息学方法,预测了可能具有生物学功能的烟草miRNA,找到烟草中的天然miRNA167前体序列。我们发现,过表达miRNA167的转基因烟草植株,其靶基因ARF8表达水平受到明显抑制。形态观察结果显示,转基因植株虽然叶片黄化,但是可以正常的开花结果。本实验找到了可以被病毒特异诱导的高表达诱导型启动子06GP1967,还对烟草内源miRNA167进行了功能验证,为下一步构建烟草病毒自动应答防治技术奠定了基础。……   
[关键词]:植物病毒;人工miRNA;启动子;烟草
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽农业大学2014年