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来自于Melanocarpus albomyces内切型葡聚糖酶/漆酶融合酶的构建及酶学性质的分析

范远鑫

  废纸已经成为了一种重要的可再生资源,虽然废纸回收利用技术已经成熟,但是在废纸回收中仍然有很多问题需要我们去解决。生物酶法脱墨在造纸工业中得到广泛应用。利用纤维素酶、半纤维素酶对旧报纸进行脱墨的研究已经基本实现工业化。探索其他可用于废纸脱墨的酶对酶法脱墨的发展有很重要的意义。在工业生产中,双功能的酶相比于分别培养两种单酶能节省原料及投入,所以应用于废纸脱墨上可能更加经济有效。本研究中的内切型葡聚糖酶基因Maeg及漆酶基因Malac都是来源于高温真菌Melanocarpus albomyces。这两种酶性质相近是构建新型双功能酶的理想材料。 来自于Melanocarpus albomyces的内切型葡聚糖酶基因Maeg和漆酶基因Malac由公司合成。编码235个氨基酸的Maeg和编码623个氨基酸的Malac在巴斯德毕赤酵母KM71H中成功异源表达。再使用表达质粒pPICZαA和柔性连接肽(GGGGS)3将Maeg和Malac融合成pPICZαA-Maeg-(GS4)3-Malac,酵母发酵上清液能检测到两种酶的酶活,但是SDS-PAGE电泳检测酵母发酵上清液显示为两条带,且与两个单酶的蛋白大小一致。由于表达质粒上α-factor信号肽只与N-端Maeg相连,所以初步分析为融合蛋白能够正确表达,但是在分泌到胞外后发生降解,降解的位置很有可能在连接肽处。 为了解决融合蛋白的降解问题,用不同类型连接肽重新构建了MaEG-(GS4)2-MaLac,MaEG-CJ-MaLac,MaEG-TR-MaLac等融合蛋白,所用表达质粒均为pPICZαA。但是融合蛋白仍然降解。Native-PAGE检测显示融合蛋白降解后漆酶的活性带与单酶大小一致。通过前后蛋白互换位置以降低蛋白降解的方法构建了pPICZαA-Malac-(GS4)3-Maeg,用离子交换柱和Ni-NTAAgarose亲和纯化得到了纯酶,得率为8.28%。MaLac-(GS4)3-MaEG的比酶活较两个单酶分别有所降低。以2%CMC为底物时融合酶中的内切型葡聚糖酶比酶活为2214.8±48.95IU/μmol,较亲本酶MaEG比酶活2966.6±50.42IU/μmol降低了25.4%;以ABTS为介体时,融合酶中的漆酶比酶活为1048.28IU/μmol较亲本酶MaLac比酶活1254.95±36.28IU/μmol降低了16.4%。在温度和pH性质方面,融合酶与单酶相比总体变化不大。MaLac-(GS4)3-MaEG融合酶中MaEG在C-端相比于MaLac在C-端时降解情况明显减少。可见两种酶融和时,融合酶相对单酶酶学性质等方面会有一定的变化。 本实验构建的KM71H-Malac通过摇瓶培养后表达量比之前文献报道的要高出几十倍,并且也未见文献报道Malac基因由毕赤酵母表达。基于此,将重组单酶KM71H-Malac进行高密度发酵。5L发酵罐培养,诱导表达第7天以ABTS为底物,酶活能达到39.15IU/mL,相对于摇瓶培养达到最高酶活的发酵周期缩短了一半,且第7天酶活提高了5倍。 最后,还将融合酶MaLac-(GS4)3-MaEG进一步做了废纸浆脱墨实验。比较发现,在相同分子数的条件下,融合酶MaLac-(GS4)3-MaEG脱墨的效果较MaLac、MaEG两种亲本酶有较明显提高。可见融合酶用于废纸脱墨上更经济有效。……   
[关键词]:融合酶;内切葡聚糖酶;漆酶;高密度发酵;脱墨
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京林业大学2014年