手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

艾烟可吸入颗粒物对人肺腺癌A549细胞增殖及基因表达谱的影响

刘平

  目的观察艾烟PM10对人肺腺癌A549细胞增殖及基因图谱的影响,全面深入地探讨艾烟PM10对肺腺癌A549细胞的潜在药性作用或(和)毒性作用机制,为今后艾烟的研究寻找更明确的方向,同时为其安全性研究提供参考。 方法本研究采用体外实验方法,以A549细胞为研究对象,用MTT法观察了艾烟PM10对其活力的影响,对比了艾烟PM10、香烟烟气PM10及广谱抗癌药顺铂对A549细胞以及人支气管上皮细胞BEAS-2B活力的影响;采用流式细胞术观察了艾烟PM10对A549细胞周期的影响,检测了艾烟PN10对A549细胞内活性氧(ROS)水平的影响;采用Hoechest33258染色法用荧光显微镜观察艾烟PM10对A549细胞的凋亡形态学的影响,并对细胞内Ca2+水平以及Caspase9、Caspase3/7活性和NF-κB(p65)表达量进行检测;采用新一代基因测序技术——数字基因表达谱法(Digital Gene Expression profiling, DGE)观察了艾烟PM10对人肺腺癌A549细胞基因表达谱的影响,筛选出艾烟PM10处理后差异表达的基因,对其差异基因表达模式进行聚类分析、Gene Ontology功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析,筛选了艾烟PM10干预A549细胞的过程中差异表达的基因及它们参与的生物过程和最主要的信号转导途径,分析了差异基因与A549细胞周期、细胞凋亡之间的关系。 结果艾烟PM10对A549细胞增殖影响的实验结果如下: (1)艾烟PM10对A549细胞活力的影响 24h干预组内,与溶剂对照组相比,经不同浓度艾烟PM10处理过的A549细胞活力均显著降低(p<0.05,p<0.01);48h干预组内,与溶剂对照组相比,经不同浓度艾烟PM10处理过的A549细胞活力均显著降低(p<0.01);各艾烟PM10处理组内比较,随浓度增加,细胞活力显著降低(p<0.01);与24h干预组内同浓度艾烟处理组相比,48h干预组内艾烟PM10处理各组细胞存活率均显著降低(p<0.01)。 (2)艾烟PM10、香烟侧流烟气PM10及顺铂对A549细胞活力的影响 三种样品同一浓度组间比较,顺铂组A549细胞存活率均低于艾烟PM10组和香烟PM10组(p<0.01):40μg/ml组间比较,艾烟PM10组与香烟PM10组内A549细胞存活率无显著差异(p>0.05),其余各浓度组间比较,艾烟PM10组A549细胞存活率均显著低于香烟PM10组(p<0.05)。 (3)艾烟PM10、香烟侧流烟气PM10及顺铂对支气管上皮细胞BEAS-2B活力的影响 三种样品同一浓度间细胞存活率比较,香烟干预组BEAS-2B细胞活力均显著低于艾烟干预组(p<0.05);顺铂干预组的细胞活力,除100μg/ml组与艾烟干预组无差异(p>0.05)外,其余各浓度组细胞活力均显著低于艾烟干预组(p<0.05);40μg/ml组间比较,顺铂干预组细胞活力显著低于香烟PM10干预组,然而80μg/ml和100μg/ml组间比较时,香烟PM10干预组细胞活力却显著低于顺铂组。 (4)艾烟PM10干预24h对A549细胞周期的影响 与对照组相比,艾烟PM10处理各组S期细胞比例显著增加(p<0.05)。 与160μg/ml组相比,其余两个艾烟PM10处理组内S期细胞显著降低(p<0.05);400μg/ml时,G1期细胞比例显著上升,G2期细胞比例显著下降,差异均有统计学意义(p<0.01).320μg/ml时,G1期和G2期细胞比例均无显著变化(p>0.05)。 与320μ g/ml组相比,浓度为400μg/ml时,G1期细胞比例显著升高(p<0.05),G2期细胞比例无显著差异(p>0.05). 经艾烟PM10处理过的各组细胞在流式细胞图中出现了明显的“凋亡峰” (5)艾烟PM10干预4h对A549细胞内ROS水平的影响 与对照组相比,艾烟PM10处理各组细胞内ROS水平均显著降低(p<0.05). (6)艾烟PM10对A549细胞凋亡形态学的影响 艾烟PM10处理4h在400μg/ml时出现部分凋亡细胞。 (7)艾烟PM10对A549细胞内Ca2+水平的影响 艾烟PM10干预A549细胞4小时后,随浓度增加,细胞内Ca2+水平显著增加(p<0.01). (8)艾烟PM10对A549细胞内Caspase9、Caspase3/7活性的影响 与对照组相比,经不同浓度艾烟PM10处理后,A549细胞内Caspase9活性无差异(p>0.05).当艾烟PM10浓度为280μg/ml时,细胞内Caspase3/7活性明显下降(p<0.01);而浓度为140μg/ml时,Caspase3/7活性无明显变化(p>0.05)。 (9)艾烟PM10对A549细胞NF-κB(p65)表达的影响 与空白对照组比,艾烟干预4小时,各浓度组A549细胞内NF-κB(p65)表达量均降低(p<0.05);干预20小时,70μg/ml组和280μg/ml组内p65表达量均降低(p<0.05),140μg/ml组内p65含量无明显变化(p>0.05)。相同浓度下,不同时间的艾烟干预各组间对比,p65表达量无明显变化(p>0.05). 艾烟PM10对A549细胞基因表达谱的影响实验结果如下: (1)差异基因筛选 与对照组相比,艾烟干预4小时差异表达基因共1109条(上调602条,下调507条);干预20小时差异表达基因共3565条(上调1394条,下调2171条)。与艾烟干预4小时相比,干预20小时后差异表达的基因有2149条(上调1010条,下调1139条). (2)差异基因表达模式的聚类分析 在艾烟PM10干预的过程中(干预4h、干预20h及从4h到20h的过程中)均有差异表达的基因共有316条,这些基因在艾烟PM10干预4h后,以上调为主;在干预20小时后,则以下调为主. 在艾烟PM10干预的过程中差异表达的基因总共有4415条。对促进细胞周期进程的基因以下调为主。艾烟干预过程中,对促凋亡基因BAD在干预4h时上调,随时间延长又表现为明显下调;对Caspase家族基因和抑制凋亡的基因Bcl家族也时而促进,时而抑制。 (3)差异基因参与的生物功能显著性富集分析 与空白组相比,艾烟PM10干预4h引起差异表达的基因涉及1425个生物过程。其中,显著富集的生物功能共有39个,富集最为显著的为“细胞周期”。 与空白组相比,艾烟PM10干预20h引起差异表达的基因涉及2211个生物过程。其中,显著富集的生物功能共有77个,富集最为显著的为“细胞代谢”。 与干预4h相比,艾烟PM10干预20h引起差异表达的基因涉及1786个生物过程。其中,显著富集的生物功能共有22个,富集最为显著的生物过程为“细胞过程”。 (4) Pathway显著性富集分析 与空白组相比,艾烟PM10干预4h引起差异表达的基因涉及214条信号通路或生物代谢途径。其中,显著富集的有细胞周期、内质网中的蛋白处理、氧化磷酸化、幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号、p53信号途径及亨廷顿氏病。 与空白组相比,艾烟PM10干预20h引起差异表达的基因涉及228条信号通路。其中,显著富集的信号通路由高到底排列如下:细胞周期、DNA复制、代谢通路、剪接酶、糖胺聚糖的生物合成-硫酸角质素、嘧啶代谢、卵母细胞减数分裂、幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号、内质网的蛋白处理、泛素介导的蛋白水解、氧化磷酸化、黏附连接点、p53信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚合成、叶酸参与的单碳池代谢、亨廷顿氏病以及Wnt信号通路。 与干预4小时相比,艾烟PM10干预2h引起差异表达的基因涉及221条信号通路。其中,显著富集的信号通路由高到底排列如下:细胞周期、嘧啶代谢、DNA复制、p53信号通路、剪接酶。 结论 1.艾烟PM10对具有抑制人肺腺癌A549细胞增殖的作用。艾烟PM10对支气管上皮细胞BEAS-2B的毒性低于香烟PM10,对A549细胞的增殖有抑制作用,而香烟在同等浓度时对A549细胞活力无影响,说明艾烟PM10中含有抗肿瘤的成分。 2.艾烟PM10可通过诱导细胞周期阻滞引起A549细胞死亡。艾烟PM10会引起细胞周期各阶段的明显阻滞,但以晚期阻滞作用明显。且该作用涉及对细胞周期调控的许多通路,如cyclin-CDK依赖性通路、p53调节通路、氧化还原调控以及代谢相关途径。 3.艾烟PM10可通过诱导细胞自噬引起A549细胞死亡。艾烟PM10可通过下调细胞外基质蛋白(ECM)和整合素的表达,使A549细胞出现失巢凋亡,并通过自噬作用使失巢凋亡的细胞死亡,这可能是艾烟PM10抑制癌细胞增长,诱导其死亡的主要机制之一,而且艾烟PM10可能通过该途径发挥抑制肿瘤转移和浸润的作用。 4.艾烟PM10对A549细胞凋亡的作用呈双向性,可促进又可抑制A549细胞凋亡,两种作用处于动态变化中. 5.艾烟PM10具有多种生物活性.艾烟PM10干预A549细胞引起大量差异表达的基因,这些基因参与多种生物过程,对机体的作用有利有弊,值得深入研究.……   
[关键词]:艾烟PM10;A549细胞;增殖抑制;细胞周期;细胞凋亡;基因表达谱
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京中医药大学2013年