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重组猪瘟病毒E2杆状病毒的构建及其在蚕蛹中表达重组猪瘟E2蛋白

胡刚叶

  猪瘟(CSF)又称古典猪瘟,猪霍乱或欧洲猪瘟,是由猪瘟病毒感染引起的猪的一种高度接触性热性传染病,它主要引起猪的实质器官出血及败血症,猪是唯一的自然宿主,包括驯养猪和野猪,任何年龄、品种、性别的猪和野猪均可发病。它传染性强、致病率高,给世界养猪业造成严重的经济损失,被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病。 猪瘟病毒为单股正链RNA病毒,有一个大的开发阅读框(ORF),该开放读码框编码一个大约3898个氨基酸的多聚蛋白。这个多聚蛋白在病毒感染的宿主细胞内裂解成12种病毒特异性蛋白质,其中4种为病毒的结构蛋白,8种为非结构蛋白,E0/Erns,E1,E2是具有免疫性质的3种糖蛋白。Wensvoot等(1990)研究证实,E2蛋白诱导的免疫反应足以保护被免疫猪抵抗CSFV的感染。 家蚕养殖在我国是历史悠久的传统产业,发展新兴的生物制药产业是我国新阶段的目标之一,利用家蚕反应器表达CSFV E2蛋白旨在将我国的优势产业与不断发展的分子生物学技术紧密结合起来,不仅为开发高效广谱的猪瘟亚单位疫苗打下基础,同时可以探索利用家蚕生物反应器来表达蛋白节约成本,减少制药的技术难度。 本研究旨在通过构建重组猪瘟病毒E2基因的杆状病毒在昆虫细胞和蚕蛹中表达重组猪瘟E2蛋白。根据GenBank登记的猪瘟兔化弱毒株(HM175885)的序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增出CSFV的囊膜糖蛋白E2基因,PCR产物在进行测序鉴定后,其中,引物对EHU/EHD扩增产物命名为PCR-E2,而引物对C6EU/C6ED扩增产物命名为PCR-C6E2,PCR产物通过酶切后连接到供体质粒pFastBacHBM-TOPO和pFastBacI载体上,分别命名为pFastHBM-E2和pFastBac-C6E2。将测序鉴定正确的重组供体质粒pFastHBM-E2和pFastBac-C6E2分别转化入DH10Bac感受态细胞中,经过重组培养,筛选发生重组的白色菌落,发生重组的重组杆状病毒质粒命名为Bacmid-E2和Bacmid-C6E2转染入昆虫sf9细胞,获得的重组病毒分别命名为VBac-E2和VBac-C6E2。 利用ELISA、SDS-PAGE和Westem blotting等方法鉴定了两种重组病毒均能够在昆虫细胞中分泌表达。然后,将重组病毒VBac-E2和VBac-C6E2分别注射蚕蛹后,在一定时间内收获蚕蛹血淋巴,经ELISA检测,结果表明两种重组病毒也能够在蚕蛹体内表达重组猪瘟病毒E2蛋白。并根据商品化的试剂盒和猪瘟病毒E2蛋白标准品建立了重组猪瘟E2蛋白定量检测方法,为后续开发诊断试剂盒及亚单位疫苗过程中抗原的定量奠定基础。……   
[关键词]:CSFV;E2蛋白;重组杆状病毒;分泌表达;蚕蛹;ACNPV
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河南农业大学2012年