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副溶血弧菌和溶藻弧菌快速检测体系的建立与应用

刘阳

  本研究成功建立了副溶血弧菌和溶藻弧菌的快速检测体系,包括双重PCR、纳米PCR、免疫胶体金试纸条法,并对一系列反应条件进行优化,建立了相应的检测试剂盒,并已经应用于日常的检测,检测时间从常规法的4-5d缩短为2d,大大加快了副溶血弧菌和溶藻弧菌的检测速度。现将所做工作摘要介绍如下: 1、多重PCR技术同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌方法的建立与初步应用。本研究根据副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因序列应用Primer Premier6.0设计了针对这2种细菌的2对特异性引物,并建立了能快速同时检测这两种细菌的多重PCR方法。比较分析了不同的DNA模板提取方法,证明了柱式试剂盒提取法优于直接菌体加入法、热裂解法、反复冻融法和酚-氯仿提取法;并且分别对多重PCR方法的最佳反应条件、特异性、灵敏度进行了测定,采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果表明本试验能同时扩增得到2条与试验设计相符的208bp副溶血弧菌和159bp溶藻弧菌特异性条带;与枸橼酸杆菌、沙门氏菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌没有交叉反应;纯培养细菌的检测灵敏度分别为副溶血弧菌2.32×103cfu/mL和溶藻弧菌2.56×103cffu/mL,(?)临床病料检测灵敏度分别可达副溶血弧菌2cfu/mL和溶藻弧菌3cfu/mL;将该PCR反应体系的试剂混合制成检测试剂盒,分装-20℃保存,经检测稳定性可达9个月。本试验方法操作简便快速、特异性强、灵敏度高,并且经济实惠每个PCR反应成本不到1元,值得推广应用。本试验方法的建立对于加强进出口水产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的检验检疫具有十分重要的意义。 2、纳米PCR技术检测副溶血弧菌的建立与初步应用。本研究根据副溶血弧菌的toxR基因序列,应用Primer Premier6.0设计了1对特异性引物,并建立了纳米金PCR方法,并对该方法的最佳反应条件、循环数、特异性和灵敏度进行了测定,采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果表明本试验能扩增得到与试验设计相符的208bp副溶血弧菌的特异性条带;与溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门氏菌、枸橼酸杆菌没有交叉反应;纯培养细菌检测灵敏度为3cfu/反应体系。并且将结果与普通PCR进行比较,发现同条件下本方法的灵敏度比普通PCR高10倍。本试验方法的建立对于加强进出口水产品中副溶血弧菌的检验检疫具有十分重要的意义。 3、纳米PCR技术检测溶藻弧菌的建立与初步应用。本研究根据溶藻弧菌的特异性基因toxR基因序列,应用Primer Premier6.0设计了1对特异性引物,并建立了纳金米PCR方法,并对该方法的最佳反应条件、特异性和灵敏度进行了测定,采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果表明本试验能扩增得到与试验设计相符的159bp溶藻弧菌的特异性条带;与副溶血弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门氏菌、枸橼酸杆菌无交叉反应;纯培养细菌检测灵敏度可达6cfu/反应体系,同条件下比普通PCR的灵敏度高10倍。本试验方法的建立对于加强进出口水产品中溶藻弧菌的检验检疫具有十分重要的意义。 4、快速检测副溶血弧菌免疫胶体金层析技术的研究与应用。本研究应用硫酸铵纯化法提纯后的兔抗副溶血弧菌IgG-2包被硝酸纤维素膜检测线,羊抗兔IgG包被对照线,然后用胶体金标记硫酸铵纯化法纯化的兔抗副溶血弧菌IgG-1从而建立一种检测副溶血弧菌的胶体金免疫层析试纸条法(GICA)。该法通过胶体金标记兔抗副溶血弧菌抗体直接显色,阳性者检测线出现红色线,整个试验过程仅需15-30min即可判断结果。与溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、弗氏枸橼酸杆菌和沙门氏菌等常见肠道菌不发生交叉反应。该法对副溶血弧菌的最低检测量为3.592x104cfu/mL。将试纸条4℃存放4个月、常温存放2个月,37℃存放3个周,检测结果无差异。该方法操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强并且不需要任何试验仪器,结果非常容易观察和判断,非常适于基层应用。……   
[关键词]:副溶血弧菌;溶藻弧菌;多重PCR技术;纳米PCR技术;免疫胶体金层析技术
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2012年
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