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登革Ⅱ型病毒E蛋白第一、二结构域的表达、鉴定及蚊虫组织中登革病毒受体分子的研究

付宇姣

  登革病毒(DENV)是最常见的地理分布最广的,通过节肢动物(伊蚊)传播的虫媒病毒,属于黄病毒科黄病毒属,分布于全球100多个国家,特别是热带和亚热带地区。近十年来,登革热在全世界的发病率提高了近30倍。世界卫生组织估算,全球每年登革病毒感染数目约为5千万到1亿人,而且两种以上血清型病毒的共循环,以及敏感人群的不断出现,不但导致登革热流行频率加快,也使登革病毒继发感染引起的病死率很高的登革出血热/登革休克综合征病例大量出现。目前全球大约有25亿人受登革病毒感染的威胁,每年大约有5000万人感染登革热,其中大约有210万的严重病例,50万例登革出血热,20000例死亡病例。登革病毒感染引起的病变范围很广,从自限性疾病到严重危及生命的登革热、登革出血热以及登革休克综合征。随着全球经济一体化程度的加快和气候的持续变暖、加上蚊媒的扩散速度加快、分布范围变广,登革热/登革出血热已成为热带、亚热带地区最为重要的蚊-传播毒性疾病,是重要的公共卫生问题。 登革病毒是一个正义单链RNA病毒,包括四种血清型(DENV1-4)。登革病毒基因组RNA编码3个结构蛋白衣壳蛋白、包膜糖蛋白、膜蛋白及其前体(C、 E、prM/M)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)。包膜糖蛋白E是主要的病毒颗粒包膜糖蛋白,是由494-501氨基酸残基组成的、分子质量约为55~60KDa的糖蛋白,其编码序列在虫媒病毒中的同源性较高(约为40%)且蛋白中所有Cys残基均高度保守,黄病毒属各成员E蛋白之间具有相似的结构和功能。登革病毒以同源三聚体形式存在于成熟病毒颗粒表面。结晶学的研究表明,登革病毒的包膜糖蛋白E,分为3个结构域(Ⅰ-Ⅲ)。在三个结构中,β链形成的二级结构是其主要结构。结构域Ⅰ位于E蛋白单体中央,E蛋白Ⅱ区折叠成长的指样结构,E蛋白C端的氨基酸残基构成了结构域Ⅲ。因为在所有成熟具有感染性的黄病毒中E蛋白均是由与病毒融合有关的同源二聚体形成,推断E蛋白的所有结构都可能和病毒与细胞的融合过程有关。其中E蛋白Ⅱ区中第98-111位氨基酸残基组成的cd环,富含甘氨酸且具有很强的疏水性,序列组成在几乎所有的虫媒黄病毒中高度保守。最近研究发现,cd环可在E蛋白由二聚体向三聚体的转变过程中插入胞膜,参与病毒与宿主细胞膜的融合,被认为是病毒融合靶点,或认为是潜在的病毒融合肽。推断第一、第二结构域可能与登革病毒发病机制相关。 病毒受体可以定义为位于宿主细胞表面能够被病毒吸附蛋白(virus attachment protein,VAP)识别并与之结合,从而引起病毒感染的分子复合物,其化学本质是糖蛋白、蛋白聚糖、脂类或糖脂,大多属于蛋白质。病毒对细胞的感染过程实质上就是病毒与宿主细胞作用的过程,病毒与细胞表面受体的结合是发生病毒感染的前提条件。这种结合作用客观上反映了病毒结构蛋白与受体空间构象上的对应关系。在登革病毒的初次感染过程中,位于病毒颗粒表面的结构蛋白与细胞表面上的受体结合,并通过膜整合或内吞作用细胞,进而启动 一系列生物学事件。而在登革病毒的二次感染过程,登革病毒还可与体内业已存在的病毒特异性非中和抗体(如IgG)形成免疫复合物,并通过细胞上的Fc受体结合进入细胞,这种抗体依赖性感染增强(antibody-dependent enhancement,ADE)作用可能与登革出血热,登革休克综合征的发病机制有关。病毒与细胞受体的特异结合是病毒在长期进化中与宿主相互作用的结果。病毒为了获得更多的感染机会,通常能够根据入侵途径和靶细胞的不同,通过进化获得识别多种细胞受体的能力,最大限度地满足自身增殖的需要。目前认为,病毒与受体的结合是一个多步骤过程,涉及不同的病毒吸附蛋白及多个靶细胞受体,细胞表面的结合分子可以是特异性的,也可以是非特异性的,病毒可能与一个以上的细胞表面分子结合,且同一病毒与不同细胞所结合的受体可能不同。目前实验室鉴定的潜在的登革病毒受体不下十几种。作为典型的蚊媒病毒,登革病毒既能在蚊虫细胞中有效复制,也能感染人体并导致发病,其在蚊虫细胞中致病机理的研究历来受到重视。随着受体研究的逐步深入,蚊传黄病毒的致病机制有望得以最终阐明,将在选择抗病毒药物靶点、设计新型疫苗中发挥不可估量的作用。 目的: 1.在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第一、二结构域(DⅠ,D Ⅱ),并对其进行免疫反应性鉴定; 2.哺乳动物BHK-21细胞连接登革Ⅱ型病毒受体分子,并对其进行功能研究; 3.不同期白蚊伊蚊总蛋白的提取及潜在受体的筛选。 方法: 1.登革Ⅱ型病毒接种乳鼠,提取总RNA; 2.并设计一对特异性引物,经RT-PCR扩增目的片段; 3.以DV2-E-D1&2载体为模板,PCR扩增E蛋白D1&2基因片断并纯化; 4.双酶切PCR纯化产物和质粒pET-28a (+),构建重组质粒pET28a-DV2-E-D1&2; 5.筛选阳性菌落,并转化至E.coli BL21感受态细胞; 6. IPTG诱导表达,表达目的蛋白进行SDS-PAGE分析,并进行Western blot鉴定重组蛋白免疫反应性; 7.哺乳类动物细胞BHK-21的培养; 8.登革病毒的扩大培养与纯化; 9. RT-PCR法及间接免疫荧光法(IFA)检测细胞感染登革病毒; 10. VOPB A (Virus overlay protein blot binding assay)病毒覆盖蛋白结合试验)方法筛选BHK-21细胞连接登革Ⅱ型病毒的受体分子; 11.白蚊伊蚊的饲养; 12.不同期白蚊伊蚊总蛋白的提取及潜在受体的筛选。 结果: 1.提取乳鼠总RNA, RT-PCR扩增得到约900bp的E蛋白第一、二结构域基因片段; 2.重组质粒pET28a-DV2-E-D1&2经Xho1和Nde1双酶切后,可见约900bp大小的酶切片段; 3.重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-DV2-E-D1&2经IPTG诱导后在37KDa位置有明显的诱导后表达带,其大小与预测值一致。超声裂解重组菌后,分别取上清与沉淀经12%SDS-PAGE分析,显示重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中; 4. Western blot结果显示,重组菌诱导前的全菌蛋白没有与His·Tag单抗及登革病毒单抗(D1-11)反应的条带,而诱导后的全菌蛋白和在相对分子质量为37000的位置均有与His·Tag单抗反应的特异条带; 5.与重组诱导前的全菌蛋白无反应,只在诱导后的全菌蛋白中有特异的条带出现,且与预测的相对分子质量为37000的位置相符合; 6.BHK-21细胞蛋白病毒孵育组在30KDa及60KDa的位置有特异性的条带出现,而阴性对照组无此条带;7.在白纹伊蚊幼虫、蛹和雌蚊中得到约35KDa大小的条带,而雄蚊无这一分子,提示白纹伊蚊35kDa的DENV连接分子呈现登革病毒组织向性,推测其具有特异性。 结论: 1.成功地在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第一、二结构域(DI,DII),对其进行免疫反应性鉴定,鉴定结果表明其具有良好的免疫反应性; 2. VOPBA法初步筛选出两个BHK-21细胞连接登革Ⅱ型病毒的30及60KDa的病毒结合分子,R30/60蛋白分子进一步鉴定和功能研究正在进行; 3. VOPBA法初步筛选出的35KDa分子在除了雄蚊以外的三个阶段均具有,推测其具有特异性。对其进一步的鉴定和功能研究正在进行。……   
[关键词]:登革病毒;E蛋白第一、二结构域;表达;免疫印迹;BHK-21细胞;白纹伊蚊;受体;VOPBA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南方医科大学2012年