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反相液相色谱快速分离珠蛋白肽链及其应用研究

万均辉

  背景与目的 血红蛋白(hemoglobin, Hb)是人体内氧的运输体,每个血红蛋白由四条珠蛋白肽链组成四聚体,其中包含两个α类亚基和两个β类亚基,每个亚基又分别携带一个血红素。正常人体血红蛋白存在胚胎、胎儿和成人3个不同发育阶段。由于机体对于氧气需求不同,因此,不同的发育阶段所合成的血红蛋白种类也存在一些差异。这些不同发育阶段的血红蛋白为不同珠蛋白肽链所组合而成的四聚体结构,在胎儿期和成人期,α-链分别以γ-链(根据136位氨基酸的不同可分为Gγ和aγ形成Hb F (fetal hemoglobin, α2γ2),或与δ-链形成Hb A2(α2δ2),或与β-链形成Hb A (adult hemoglobin, α2β2);而在胚胎期,α类珠蛋白肽链还有ζ-链,ζ-链与γ-链形成了Hb Portland(ζ2γ2)或与ε-链形成Hb Gower1(ζ2ε2),此外,α-链与ε-链形成Hb Gower2(α2ε2)。 当珠蛋白肽链编码基因发生缺陷时,将导致两类不同的珠蛋白肽链改变,一类致使珠蛋白肽链合成减少或缺如,使形成血红蛋白的α-链/非α-链比例失衡,而导致一组遗传性溶血性疾病,称为地中海贫血,轻者可无临床表现,重者以进行性溶血性贫血为主要特征,根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型,地中海贫血可以分为α-地中海贫血、β-地中海贫血、δ-地中海贫血、γ-地中海贫血、δβ-地中海贫血和εγδβ地中海贫血等;另一类致使珠蛋白的一级结构发生改变,从而导致血红蛋白的分子结构发生改变,称为异常血红蛋白,大多数异常血红蛋白并不引起临床表型,但有少数异常血红蛋白导致明显功能改变,如溶血性异常血红蛋白Hb S及可引起地中海贫血样变的Hb E、Hb CS、Hb QS等可在单独存在或者复合地中海贫血时表现为中间型或重型地中海贫血。 这两类遗传性血液病的常用确诊方法依赖于基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的分子诊断技术,如缺口-PCR(Gap-PCR)、反向点杂交(reverse dot blot, RDB)、变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)及高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melting, HRM)等均已被应用于相关突变检测。尽管如此,表型研究在血红蛋白病的临床诊断及研究中占据着重要地位。没有表型指导下直接进行分子诊断则意味着耗时、高成本,同时使误诊风险加大,基因型与表型关系的复杂性也加大了诊断的困难,因此联合多种检测手段对于正确诊断显然是必要的。血液学表型分析和血红蛋白分析是目前指导后续分子诊断的重要参考指标。而珠蛋白肽链检测是表型研究中的重要技术之一,对于观察珠蛋白肽链合成改变或检测异常珠蛋白肽链均具有重要意义。目前其分析技术主要分为两大类,一类基于电泳原理,主要有醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、垂直等电聚焦及毛细管电泳;另一类则基于色谱分离原理,主要有羧甲基层析柱法和反相液相色谱法(reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)。两类技术改进的方向均为提高分辨率和减少分析时长。其中反相液相色谱法得益于其高分辨率以及自动化分析是目前用于珠蛋白肽链分析的主流技术,尽管目前出现各种基于该法的检测条件,但目前其仍面临两个主要技术短板,样品预处理繁琐,为获得较高分辨率所需分析时间仍较长。另外一个重要技术问题是,由于目前所报道的色谱条件五花八门(包括所使用的色谱柱和洗脱条件),而对于无现成条件可参考的反相色谱柱而言,其用于珠蛋白肽链分析的初始条件摸索和进一步的优化显然不是一件容易的工作。 本研究的主要目的是基于反相液相色谱建立一种珠蛋白肽链快速分离方法,并探讨该法在地中海贫血和异常血红蛋白中的应用价值,同时观察相关参数对色谱分离行为的影响,为与珠蛋白肽链分析相关工作提供有参考价值的经验。 材料与方法 1.样本收集:共收集了临床样本301例,其中正常样本106例,α-静止型和标准型共60例(2例合并Hb WS),Hb H病59例,β-地中海贫血携带者46例(其中2例合并Hb E,3例合并Hb WS),中重型β-地中海贫血30例(其中11例合并Hb E,2例合并Hb WS).样本首先进行血常规和血红蛋白分析,标准型α-地中海贫血分子诊断的血液学指标为:MCV<80几,MCH<27pg,HbA2正常或偏低,Hb F<1.0%;β-地中海贫血进行分子诊断的血液学指标为:①MCV<80fL,MCH4.0%;②检出Hb E;③Hb F>5.0%,异常血红蛋白由血红蛋白高效液相色谱分析系统进行检测;在血液学指导下进行分子诊断,用酚/氯仿方法提取基因组DNA,采用Gap-PCR技术、反向点杂交(RDB)技术检测常见α-地中海贫血缺失突变和点突变;采用反向点杂交(RDB)技术检测常见β-地中海贫血点突变。 2.RP-HPLC方法的建立:总结相关参考文献,采用梯度洗脱,Phenomenex Jupiter C18色谱柱,流动相A(疏水相)为乙腈/甲醇(90:10),流动相B(亲水相)为0.5%三氟乙酸(TFA)水溶液(pH2.6),流速2.0ml/min,柱温40℃,检测波长280nm,首先用脐血和正常成人血样用作方法开发,分别采用以下三种预处理样品进样:①50μ1全血溶于1ml去离子超纯水,低速离心后进样10μl;②经0.9%生理盐水洗涤的红细胞,再用去离子超纯水和CCl4制备的血红蛋白液;③由预处理②所得到的血红蛋白液再加入酸性丙酮制备成的珠蛋白肽链粉。参阅相关文献报道,选择25%-60%乙腈疏水性范围进行筛选并优化色谱条件;观察不同流速、pH、梯度时间以及波长对色谱分离行为的影响并进行重复性评价。 3.统计分析:采用双变量相关及线性回归分析Gγ+Aγ/α与Hb F水平相关性确定实际a-峰,用EXCEL分析RP-HPLC分离珠蛋白肽链保留时间和出峰面积稳定性,数据以均数±标准差进行描述,变异系数CV以标准差与均数比率表示;采用SPSS17.0中One-way ANOVA方法进行多重比较,P<0.05认为有统计学差异,采用受试者工作特征曲线(ROC)分析法分析所选指标的筛查诊断价值。 4.应用研究:用所建立条件分析正常成人样本106例,α-地中海贫血静止型/标准型60例,Hb H病59例,p-地中海贫血携带者46例,p-地中海贫血中重型30例,基于正常组与各病例组珠蛋白肽链失衡程度(α/pre-β+β)的多重比较结果,用ROC曲线分析法分析α/β,α/pre-β+β+δ,α/pre-β+β,δ,δ/β,δ/pre-β+β对于p-地中海贫血携带者、α/β和α/pre-β+β对于Hb H病的筛查价值;另外用此法对常见异常血红蛋白进行分析。 结果与讨论 经筛选得到最优色谱条件如下:50μl全血溶于1ml去离子超纯水,低速离心后进样10μl,0-1min51%流动相B,1-2min51-50%流动相B,2-12min50-40%流动相B;在此色谱条件下,血红素(heme), pre-β,β,δ,α, Gγ, Aγ在12mmin内被很好分离。 同一样品连续五次进样,各成分保留时间变异系数(CV)为0.11-1.29%,峰面积CV为0.32-4.86%,变异系数均低于5%,证实所建方法的稳定性较好。提高流速使各成分保留时间(RT)均提前,缩短梯度时间使各珠蛋白肽链RT缩短,但分离度稍下降,降低pH将缩短heme保留时间,而对各肽链影响则并不显著,低pH环境主要是使血红蛋白四聚体解聚,以上结果提示可通过增大流速或缩短梯度时间来提高分析效率,但增大流速影响色谱柱使用寿命,缩短梯度时间可能使分辨率下降,因此实际应用中需根据研究目的作相应选择,如正常成人中Hb F较低,此时若只观察a与p相对含量而不需要研究Hb F时,则可忽略Gγ与SAγ的分离,采取缩短梯度时间来提高分析效率。本研究中,在210-220nm波长范围内,α-链和β-链峰面积比约等于1,与理论相符,并且在此波长范围内灵敏度较280nm高,但基线不平,而在280nm波长,β-链吸收面积较α-链高,主要原因为210-220nm波长范围反映肽键紫外吸收,280nm则主要反映芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸吸收,另外在280nm波长基线较平,因此较适合于定量分析。 对不同分组α/pre-β+β进行方差分析,组间F值为72.99,P<0.001,表明不同组间差异显著,多重比较结果提示,α/pre-β+β在正常组分别与Hb H病组、β-地中海贫血携带者组、β-地中海贫血中重型组间均具有显著性差异(P<0.001),但正常组与α-地中海贫血静止型/标准型组则不具有显著性差异(P>0.05),可能由于过剩肽链的降解或α-链代偿性表达增高而导致。基于多重比较结果,我们采用ROC曲线分析获得筛查β-地中海贫血携带者最优指标为δ/β,其截断值为0.026,特异性敏感性均达100%,我们的研究显示此指标对于中重型p-地中海贫血也同样有效,通过加大样本与Hb A2比较筛查效率可能值得探讨。另外此法对于提示δβ-地中海贫血和遗传性持续性胎儿血红蛋白症(hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)可能有一定价值,需进一步研究探讨。而提示Hb H病的最优指标为α/pre-β+β,其截断值为0.626,敏感性为96.6%,特异性为89.6%。另外,7例Hb WS和13例Hb E均被准确筛查出,研究中试图用此法分析另两种常见于中国人群的异常血红蛋白Hb CS和Hb QS,但却未能检测出,可能归因于这两种异常血红蛋白的降解或本法的敏感性有限。 结论 本研究建立了一种简便快速高分辨率的珠蛋白肽链反相液相色谱分离技术,可应用于地中海贫血、异常血红蛋白的临床筛查、地中海贫血治疗评价以及其他相关研究,同时本研究所采用方法开发策略及相关因素对珠蛋白肽链色谱分离行为的影响对于类似工作具有一定的参考价值。……   
[关键词]:反相液相色谱;珠蛋白肽链;地中海贫血;异常血红蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南方医科大学2012年