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三角帆蚌几丁质代谢酶基因的克隆表达和功能分析

徐波

  三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国最重要的淡水育珠母蚌。本实验克隆了三角帆蚌几丁质酶-3和甲壳素脱乙酰酶两个几丁质代谢酶基因,并通过组织特异性表达、破壳诱导表达和原核表达推测两个基因的可能生理功能;采用两种方法,磁珠富集法和5锚定PCR法构建背瘤丽蚌微卫星文库开发的SSR标记,并将开发的部分引物用于三角帆蚌进行扩增以检查引物的扩增效果及通用性。主要研究结果如下: 1.三角帆蚌2个几丁质代谢基因cDNA全序列的克隆及分子特征 三角帆蚌几丁质酶-3(Chi-3)基因的cDNA序列全长2523bp,包括196bp的5′端非翻译区(UTR),1962bp的开放阅读框,可编码653个氨基酸残基,365bp的3′端非翻译区(UTR)。和其它已知几丁质酶相似,Chi-3含有一个信号肽和3个保守结构域:1个GH18糖水解结构域和2个几丁质结合区CBM14。BLAST分析后表明该基因的氨基酸序列与其它已知生物的同种基因氨基酸序列相似度为21.3–34.4%,而与其它五个物种的相似度略高,为27.2–34.7%。进化树显示三角帆蚌几丁质酶-3与太平洋牡蛎的几丁质酶-3聚成一支,说明三角帆蚌几丁质酶-3属于双壳类几丁质酶-3家族。 三角帆蚌甲克素脱乙酰酶(Cda)基因的cDNA全长2654bp,包括347bp的5′端非翻译区(UTR),1938bp的开放阅读框,可编码645个氨基酸残基,369bp的3′端非翻译区(UTR)。分子进化树显示三角帆蚌甲壳素脱乙酰酶与棉铃虫、蓓带夜蛾、甘蓝夜蛾聚为在第四组。这个组的甲壳素脱乙酰酶基因仅含有一个信号肽序列和一个多聚糖脱乙酰结构域。 2.三角帆蚌2个几丁质代谢基因表达分析及功能研究 三角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因组织特异性表达。以β-actin基因为内参,结果显示几丁质酶-3基因在除血液以外的其它7个组织均有表达,其中在外套膜、肝、胃、肾中表达相对较高,而在肠、鳃、斧足中表达量相对较低;甲壳素脱乙酰酶基因在8个组织均有表达,其中在外套膜、胃、斧足中表达相对较高,而在血液、肝、肾、肠、鳃、中表达量相对较低。 三角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因破壳诱导表达。三角帆蚌外套膜中几丁质酶-3基因的表达量在破壳后的12小时显著增加(p>0.05),而随后逐渐降低到正常水平;甲壳素脱乙酰酶基因的表达量在破壳后无显著增加(p>0.05)。 三角帆蚌几丁质酶-3基因和甲克素脱乙酰酶基因原核表达。三角帆蚌几丁质酶-3基因的原核表达以IPTG终浓度1mmol/L,24℃为最佳诱导表达条件,SDS-PAGE电泳检测图谱显示,1-4h重组蛋白的表达量呈明显上升的趋势,4-8h重组蛋白表达量增速减缓。本实验选用pGEX-5X-1载体,其表达产物为融合蛋白,含有一个26KD的GST标签和大小为约10KD的几丁质酶-3结构域,融合蛋白大小为36KD;甲克素脱乙酰酶基因的原核表达以IPTG终浓度1mmol/L,37℃为最佳诱导表达条件,SDS-PAGE电泳检测图谱显示,1-8h重组蛋白的表达量呈上升的趋势。其表达产物融合蛋白含有一个26KD的GST标签和大小为约7KD的甲壳素脱乙酰酶酶结构域,融合蛋白大小为33KD,本研究结果可以为后续实验酶活性测定奠定基础。 3.背瘤丽蚌30对多态性微卫星标记的开发及其三角帆蚌的通用性研究 从磁珠富集法获得的微卫星序列阳性克隆率为69.2%,重复次数超过10的占总数的70.2%,从设计的28对引物中筛选得到多态性引物11对,开发效率为39.3%。这11对引物用于养殖群体的遗传多样性的分析,结果显示等位基因数范围在4-13之间,观测杂合度、期望杂合度范围分别在0.2051-0.7381、0.5656-0.8393之间。而5 锚定PCR法获得的微卫星序列阳性克隆率为97.8%,重复次数超过10的占总数的24.7%,从设计的56对引物中筛选得到多态性引物19对,开发效率为30.4%。这19对引物用于养殖群体的遗传多样性的分析,结果显示等位基因数范围在3-10之间,观测杂合度、期望杂合度范围分别在0.2083-0.8944、0.4305-0.8961之间。实验过程和结果表明磁珠富集法所获微卫星序列质量高,开发微卫星标记效率较高;而5锚定PCR法实验操作更简便,所获得的引物遗传多样性指数更高。两种方法开发的引物均可用于背瘤丽蚌和近缘种的野生种质资源遗传多样性的研究。 选用两种方法所开发的18对微卫星引物用于我国非常重要的淡水育种蚌-三角帆蚌的遗传多样性研究。其中10对在三角帆蚌群体中具有较高的多态性,说明所开发的微卫星引物质量较好,可用于淡水蚌的遗传多样性研究。……   
[关键词]:三角帆蚌;基因表达;珍珠形成;微卫星开发
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:上海海洋大学2012年