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鸭坦布苏病毒巢式PCR检测方式及其重组E蛋白间接ELISA诊断方法的研究

郝明飞

  2010年4月以来,我国东南部分地区饲养的种鸭和蛋鸭爆发了鸭坦布苏病毒病,以产蛋急剧下降为特点,给养鸭业造成了巨大的损失,因此有必要建立一种快速、敏感、特异的诊断方法。分子生物学技术的发展为黄病毒属病毒的快速诊断带来了新的策略。 参照GenBank已登录的黄病毒基因序列设计黄病毒通用引物,建立了基于黄病毒通用引物的高敏感巢式PCR检测方法,为黄病毒、特别是新发黄病毒提供了高效的检测方法。该方法通过序列的比对,选择NS5基因保守区设计了两对通用简并引物Flav P1-Flav P4,在此基础上建立了巢式PCR检测方法,并应用到鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTV)的检测中。该方法仅能扩增鸭坦布苏病毒目的基因而不能扩增其他病毒,且敏感性达到90个拷贝·μL-1,比普通PCR高出1000倍。以上结果表明,设计的黄病毒引物具有良好的敏感性和特异性,其巢式PCR敏感性高,并成功的进行了鸭坦布苏病毒的检测。同源性和进化分析表明,新发黄病毒属蚊媒黄病毒类恩塔亚病毒群,与坦布苏病毒及近期报道的鸭坦布苏病毒分离株BYD关系最近。本研究表明该检测方法可以用于该病的临床诊断和流行病学调查,并阐明了鸭坦布苏病毒的进化地位。 包膜蛋白(E蛋白)是黄病毒的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。从规模化养鸭场分离到6株鸭坦布苏病毒,并采用特异性引物成功扩增出E蛋白基因。结果表明,E基因全长1503bp,编码501个氨基酸,序列高度保守。将E基因克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和序列测定无误后,再将该基因克隆到表达载体pET21a中,并转化E. coli后进行诱导表达。采用原核表达系统对E基因进行了表达,经SDS-PAGE分析,E蛋白大小54.3kDa,主要以包涵体形式存在。Western blot分析结果表明,表达经亲和层析法纯化后的蛋白能与阳性血清发生特异性反应。亲和层析法从表达产物中纯化目的蛋白,从而为制备鸭坦布苏病毒实验室诊断抗原和分析E蛋白的基因结构与功能的关系奠定了基础。 中和试验(NT)和血凝抑制试验(HI)是目前诊断黄病毒感染的最特异方法,然而中和试验耗时较长,费时费力。为建立快速检测鸭坦布苏病毒的血清学方法,以纯化的表达产物作为包被抗原,初步建立了针对E蛋白抗体的间接ELISA检测方法。对ELISA各种反应条件进行了摸索,确定了最适工作条件。优化后确定的抗原最适包被浓度为7μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶320,酶标抗体最适稀释度为1∶1000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.3244。本研究快速检测鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA的初步建立为该病的检测和流行病学调查提供了新的方法。……   
[关键词]:鸭坦布苏病毒;巢式PCR;包膜蛋白;间接ELISA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2012年