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仔猪腹泻相关基因GPI1的筛选及其功能研究

何俊

  本文通过在湖南湘潭沙子岭猪保种场随机选取亲缘关系相近的33头一周龄内的仔猪和30头湖南农业大学种猪场一周龄内大约克仔猪,共63头,屠宰后迅速取肝、小肠等组织样品,提取RNA、DNA;截取空肠组织,用于制备上皮细胞刷状缘,鉴定F4受体黏附表型。 文章采用aCGH芯片筛选F4受体相关CNVs,针对ETEC F4ad受体,对其候选基因GPI1进行了克隆,获得了该基因的相关序列,利用生物信息学软件和工具预测了该基因的蛋白质理化性质、结构和功能,进一步对GPI1基因进行了定量表达分析,弄清楚该基因的基本表达规律,最后通过对基因的两个SNP位点与黏附特性的关联分析,期望找到有效的遗传标记,应用与育种实践。文章获得了以下主要研究结果。 1.利用aCGH芯片,在猪的全基因组范围内筛选与F4受体有关的CNVs,找到了F4ab,ac,ad三种受体相关CNVs所在的染色体位置,以及CNVs产生的原因,其中F4ab、F4ac受体分别有11个和48个CNVs,而F4ad受体有66个CNVs; 2.通过对获得的CNVs作进一步分析,找到了与CNVs对应的相关基因。发现糖代谢有关基因、SLC基因家族、ZNF基因家族、KIF基因家族、Toll like受体5基因、U6等基因多次出现,这些基因都与动物疾病和免疫力密切相关。尤其是GPI1基因,很可能是ETEC F4ad受体的候选基因。 3.通过对GPI1基因的克隆测序,获得了GPIl基因1515bp的序列,通过与GenBank中的序列进行BLAST比对分析,发现与猪和人的GPI基因高度同源,一致性在90%以上。 4.将获得的GPI1基因序列提交到了GenBank中,登录号为JX125039。 5.通过对GPI1基因氨基酸预测,GPI1共出232个氨基酸组成,相对分子量为24964.5,理论等电点为9.44,其氨基酸组成中Leu的含量达19.8%,高于其它氨基酸含量8.2%—19.4%,不稳定参数为39.82,属于稳定蛋白,半衰期为30h。该蛋白脂肪系数为122.80,平均疏水度为0.512。氨基酸序列不含信号肽区域。利用TMHMM程序对猪GPI1进行跨膜区分析,该蛋白为疏水蛋白,这与GPI1作为F4ad受体的基本特征相符。在232位氨基酸间有3个跨膜区,这与GPI1作为细胞重要的信号传导成分的特征一致。SOPMA程序预测其二级结构:α—螺旋50.86%,p—转角4.74%,伸展链10.78%,无规卷曲33.62%。 6. GPI1基因在黏附和不黏附的不同黏附类型中,在不黏附的小肠中表达量比黏附的表达量高,并且同一黏附类型中,沙子岭猪样品中的GPI1基因在小肠的表达量比大白猪高,且两种黏附类型和两个品种间的GPI1基因表达量差异显著(P<0.05)。在不同品种中,也是不黏附型比黏附型要高,且黏附和不黏附仔猪的表达量差异显著(P<0.05);而在两个品种不同组织的表达量也差异显著(P<0.05),肝脏中的表达量比小肠中的表达量要高。 7.通过利用生物信息学预测SNP和内切酶位点,采用PCR-RFLP进行验证,发现了exon3的25bp处存在C→T的突变,exon5的211bp处存在G→C的突变。将两个外显子的SNP分别与黏附特性进行关联,发现这两个外显子的SNP与黏附特性存在相关,可以作为腹泻抗性的潜在遗传标记。……   
[关键词]:;腹泻;GPI1基因;基因功能
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖南农业大学2012年