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翘嘴鳜肌球蛋白重链(MyHC)基因的克隆及其特征分析

陈小保

  肌球蛋白重链(MyHC)是骨骼肌的主要结构和收缩蛋白。本文以翘嘴鳜背侧白肌为实验材料,采用Trizol法提取白肌总RNA,然后反转录合成单链cDNA为模板,根据Genbank数据库中相近物种的MyHC基因保守序列,设计三对引物,分别通过三组PCR克隆、产物测序、序列拼接后获得翘嘴鳜肌球蛋白重链基因的完整开放阅读框。 翘嘴鳜MyHC基因阅读框全长5814bp,编码1937个氨基酸,分子量大小大约为220kDa,其等电点为5.61。其中疏水性氨基酸606个(A,I,L,F,W,V),亲水性氨基酸451个(N,C,Q,S,T,Y),1937个氨基酸中亲水性氨基酸多集中于100-800位,而疏水性氨基酸多集中在Myosin_tail_1保守区域。由于疏水性氨基酸所占的比例比较大,总体上翘嘴鳜肌球蛋白重链属于疏水性蛋白。翘嘴鳜肌球蛋白重链强碱性氨基酸309个(K,R),强酸性氨基酸355个(D,E),强碱性和强酸性氨基酸含量差别不太大。密码子统计分析也表明:翘嘴鳜肌球蛋白重链cDNA的碱基组成不存在明显的偏好性,但是整个cDNA序列中C和T碱基含量较低,仅分别为20.9%和20.31%。同时,各个位点的碱基含量也各不相同,第一位碱基具有较高的A和G碱基(35.1%,37.1%),第二位具有较高的A碱基(43.8%),第三位具有较高的G碱基。 翘嘴鳜MyHC主要是由3部分组成:S1、S2和LMM区域。其中S1区有三个ATP结合位点、三个actin结合位点和两个Loop表面环。通过氨基酸序列比对发现,翘嘴鳜MyHC的S1、S2和LMM三个区域与大眼鳜、白姑鱼和鲤鱼等鱼的同源性分别为90.7%-95.7%、91.5%-93.7%和89.9%-99.5%,具有很高的同源性。其中三个ATP结合位点和三个actin结合位点高度保守,而两个Loop表面环保守性较低。 通过GenBank中查询得到11种鱼的MyHC的氨基酸序列,利用CLUSTALX1.83和MEGA4.0软件与本实验所克隆出来的翘嘴鳜MyHC的氨基酸序列构件系统发育树。进化树结果表明,翘嘴鳜和同属的大眼鳜肌球蛋白重链基因的亲缘关系最近,其与薄鳞突吻鳕,粗鳞突吻鳕,鳄蛇鲻等的遗传距离较远,与形态学分类结果一致。我们对鳜鱼MyHC基因的研究为以后研究鱼类肌纤维的分子分型奠定基础,为提高鱼类品质提供一定的理论基础和技术支撑。……   
[关键词]:翘嘴鳜;肌球蛋白重链;克隆;序列分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南昌大学2012年