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中国水仙ACS和ACO cDNA全长克隆、ACS反义表达载体构建及遗传转化研究

刘敏

  本研究以中国水仙叶片为材料,首先通过RACE克隆得到在乙烯生物合成中的关键基因ACS基因和ACO基因的cDNA全长,通过生物信息学分析对其功能与结构进行预测。其次,将中国水仙叶片ACS基因的保守片段反向接入载体pCAMBIA1302中,构建了中国水仙ACS基因自身反义表达载体,并进行了烟草的遗传转化研究。本试验还进行了中国水仙鳞茎盘切块诱导愈伤组织的研究,优化了中国水仙愈伤组织诱导的培养基,为进一步进行中国水仙的遗传转化提供了参考。主要研究结果如下: 1中国水仙ACS基因的克隆 本试验通过RACE技术克隆得到中国水仙叶片ACS基因的5’cDNA序列(GenBankGU182503)。根据DNAMAN6.0软件与已有序列拼接,得到中国水仙ACS基因cDNA全长,共1790bp,其中包含93bp的5 UTR,224bp的3 UTR,3′端还含有17个poly(A)尾。利用DNAMAN6.0软件预测出中国水仙ACS基因开放阅读框(ORF)共有1473个碱基组成,一共编码490个氨基酸,ATG为起始密码子、TAA为终止密码子。 应用生物信息学软件对中国水仙ACS基因编码的蛋白结构及功能进行预测和分析可知,中国水仙ACS蛋白分子量为54899.6,等电点pI:8.19,属于碱性蛋白;通过对其进行亲疏水性分析可知是亲水蛋白;不存在信号肽,属于非分泌蛋白,同时很可能是一个跨膜蛋白。没有卷曲螺旋的形成。通过亚细胞定位可知此蛋白可能位于细胞质,也有可能在细胞核。通过对其进行蛋白质二级结构预测显示,中国水仙叶片ACS蛋白由32.22%的α螺旋、18.71%的延伸链和49.06%的不规则卷曲组成。不规则卷曲和α螺旋是其最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中。与其他植物的氨基酸序列的同源性为96%~100%。在序列中还有一个I类转氨酶磷酸吡哆醛附着位点。通过对其进行同源蛋白质家族和保守结构域的分析与预测,可知此蛋白属于ACC SYNTHASE家族,包含了Aminotransferase, classI/class II结构域,Pyridoxal phosphate-dependent transferase, major region, subdomain2结构域,以及Aminotransferases, class-I,pyridoxal-phosphate-binding site化学反应结合位点。在该蛋白家族收录的蛋白质家族成员中,细菌域最多,果蝇和线虫最少。在此蛋白中分别有14个Ser、7个Thr、1个Tyr磷酸化位点。利用同源建模的方法,预测中国水仙叶片ACS蛋白的三维结构主要由β-折叠和不规则卷曲组成,与参考蛋白的序列比对一致性为66.90%。 2中国水仙ACO基因克隆 本试验利用RACE技术,分别克隆得到中国水仙叶片ACO基因cDNA的保守区,3’序列和5’端序列。利用DNAMAN6.O软件对得到的序列进行拼接,得到中国水仙叶片ACO基因cDNA全长(GenBank JQ002569),共1208bp,其中5 UTR为74bp,3 UTR为192bp,3′端还含有14个poly(A)尾。根据DNAMAN6.0软件推测出此基因的开放阅读框(ORF)共有942个碱基组成,编码313个氨基酸,ATG为起始密码子、TAA为终止密码子。 应用生物信息学软件对中国水仙ACO基因编码的蛋白结构及功能进行预测,可以得出:对其理化性质进行预测得出的分子量35521.5,等电点pI5.20,属于碱性蛋白;通过对其亲疏水性进行分析表明是亲水蛋白;不存在信号肽,属于非分泌蛋白。没有发现跨膜结构。亚细胞定位为细胞质,也有可能是细胞质内质网。与其他植物的氨基酸序列的同源性为96%~100%。在序列中有一个FE20G_OXY氧化结构。在第100位到第150位氨基酸位点,可能存在卷曲螺旋。通过对其二级结构的预测及分析表明,此蛋白由30.19%的α螺旋、17.21%的延伸链和52.60%的不规则卷曲组成,在此蛋白的整体结构中,α螺旋和不规则卷曲是其最大量的结构元件,散布于整个蛋白质中。此蛋白没有同源家族,包含有Oxoglutarate/iron-dependent oxygenase结构域。此蛋白分别含有8个Ser、2个Thr、6个Tyr磷酸化位点。三维结构主要由β-折叠和不规则卷曲组成,与参考蛋白的序列比对一致性为73.62%。 3中国水仙ACS基因反义表达载体构建 本试验选用表达载体pCAMBIA1302,克隆得到中国水仙叶片ACS基因的保守区片段作为目的基因,通过双酶切及连接反应,反向接入到表达载体中。通过目的基因检测对重组质粒进行鉴定。将重组质粒导入农杆菌LBA4404感受态细胞中。本试验采用烟草作为遗传转化的受体。得到的转化烟草通过PCR检测进行鉴定,确定目的基因已经转入。 4中国水仙鳞茎盘诱导愈伤组织 本试验通过对中国水仙材料进行不同处理,研究对中国水仙鳞茎盘诱导愈伤组织的不同因素的影响。 根据分析结果可知,影响中国水仙鳞茎盘诱导愈伤组织的影响因子大小依次为;2,4-D>6-BA>KT>NAA。本试验中得到诱导中国水仙鳞茎盘诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D2.00mg·L~(-1)+KT1.00mg·L~(-1)+NAA1.00mg·L~(-1)。……   
[关键词]:中国水仙;ACS基因;ACO基因;克隆;反义表达载体构建;愈伤组织
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2012年