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水稻草矮病毒福建分离物全基因组序列的测定及其编码蛋白的亚细胞定位分析

刘妍

  水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)属纤细病毒属,由其引起的水稻草状矮化病在20世纪70年代曾经在南亚、东南亚大面积流行,造成了严重的经济损失,由介体褐飞虱进行持久性方式,不经卵传播。RGSV具有双义编码策略,是一种双义的多组分RNA病毒,由6种ssRNA组成,编码12个蛋白。 利用RT‐PCR的方法,扩增得到了福州分离物的全基因组序列。对其序列分析显示,RGSV各个基因的核酸序列和氨基酸序列与日本分离物的同源性均在98%以上。将RGSV基因组与纤细病毒属其他病毒比对后发现,RGSV的RNA3和RNA4为RGSV所特有,与其它纤细病毒属成员的RNA片段均没有同源性,这两个蛋白可能是RGSV与同为纤细病毒属其它成员间具有诸多差异的根本原因。 利用植物瞬时表达系统,将RGSV部分基因重组到pEarly Gate101载体上,转化农杆菌后注射烟草,在共聚焦显微镜下观察这些基因在本氏烟细胞内的定位情况。结果显示,P1可在本氏烟细胞中形成颗粒点状结构,P2可在细胞核内形成颗粒,P3定位于细胞核与细胞质中,P4可定位于细胞核,P5大量积累于细胞膜附近,并且自身互作形成多聚体,P6是病害特异性蛋白,可在本氏烟细胞中大量积累表达,PC6是运动蛋白,在可定为于细胞壁与胞间连丝。将构建好的入门载体pDONR221质粒连接到pDEST8TM载体上,将所获得的重组转移质粒转化DH10Bac感受态细胞,以获得重组的bacmid DNA,将bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞,通过免疫荧光技术观察目的蛋白在昆虫细胞内的亚细胞定位,连接P2的重组杆状病毒定位在细胞膜上,连接P6的重组杆状病毒侵染的Sf9细胞的整个细胞质中都带有荧光,重组的含PC5的重组杆状病毒侵染Sf9细胞,绿色荧光以点状的形式分布在细胞质中。 蛋白是生命活动的直接体现者,了解蛋白质的亚细胞定位信息,可以为我们推断蛋白质的生物学功能提供必要的帮助,同时对蛋白质的其他研究,如相互作用、进化等也能提供必要的信息。……   
[关键词]:水稻草矮病毒;亚细胞定位;荧光蛋白;免疫荧光技术
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2012年