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两种鞘翅目昆虫抗菌肽的分离纯化与活性研究

孙龙

  抗菌肽是由基因编码的一类小分子多肽,在昆虫先天性免疫系统中占有重要地位,通常由10-50个氨基酸组成,多数为碱性、阳离子肽,带2-7个正电荷,具有水溶性好、热稳定性高、活性广泛、细菌不易产生耐药性等优点,极有可能成为新一代抗生素的替代药物,因而成为生命科学、药学和免疫学研究的热点之一。昆虫是自然界种类最多、数量最大的生物类群,同时也是抗菌肽未被充分挖掘的宝库。从丰富的昆虫资源中分离、提取和鉴定具有生物活性的抗菌肽或先导化合物是昆虫抗菌肽药物研究和开发的重要步骤。 本论文以鞘翅目昆虫黄粉虫(Tenebrio molitor Linnaeus)幼虫、喙尾琵甲(Blapsrhynchoptera Fairmaire)幼虫为研究材料,通过金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)混合液针刺诱导使其产生抗菌肽,采用不同溶液对其体内的抗菌肽进行提取,经多次凝胶色谱、反相色谱、高效液相色谱,成功地从黄粉虫幼虫、喙尾琵甲幼虫粗提物中获得了具有明显抑制革兰氏阳性菌的小分子肽类,主要研究结果如下: (1)抗菌肽最佳提取溶液的筛选:通过实验比较了10%乙酸溶液、0.1%三氟乙酸溶液、Tris-HCl(pH8.0)、Tris-HCl(pH6.5)等4种不同的溶液对黄粉虫幼虫抗菌肽的提取效果,结果发现10%乙酸粗提物和10%乙酸空白对照都有抑菌作用,导致对抑菌活性的归属产生严重干扰,因而不宜做提取溶液;其余3种提取液只有0.1%三氟乙酸提取物经后续凝胶柱预纯化后,能够检测到明显的抑菌活性,所以确定0.1%三氟乙酸作为2种昆虫抗菌肽的最佳提取溶液。 (2)抗菌肽的预纯化及Tricine-SDS-PAGE:黄粉虫幼虫0.1%三氟乙酸粗提物经SephadexG50凝胶层析后,非诱导组和诱导组均得到2个峰,其中第二个峰TFADZP2、TFAYDP2对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌表现出明显的抑制作用,对大肠杆菌、绿脓杆菌无活性;喙尾琵甲幼虫0.1%三氟乙酸粗提物经Superose12凝胶柱预纯化后,非诱导组和诱导组均得到3个峰,其中第一个峰HWDZP1、HWYDP1对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌表现出抑制作用,对大肠杆菌无活性,此外诱导组HWYDP1还对绿脓杆菌表现出抑制作用;Tricine-SDS-PAGE结果表明,黄粉虫幼虫抗菌肽TFADZP2、TFAYDP2主要由分子量40kD以下的小肽组成,喙尾琵甲抗菌肽HWDZP1、HWYDP1主要由分子量20kD以下的小肽组成。 (3)抗菌肽诱导组与非诱导组活性的比较:2种昆虫诱导组和非诱导组粗提物经纯化后都能检测到抑菌活性,而且诱导组在较低浓度时对革兰氏阳性菌的抑菌圈直径明显大于非诱导组,抑菌活性较强,表明实验得到的2种昆虫抗菌肽在体内都有基础表达,经菌液诱导后活性有所增强。对喙尾琵甲来说,诱导组还增加了对绿脓杆菌的抑制活性,说明诱导可能导致抑菌谱扩大。 (4)黄粉虫抗菌肽的纯化及鉴定:经两步Superdex Peptide凝胶色谱、一步反相色谱和一步高效液相色谱,从黄粉虫幼虫诱导组纯化出一个具革兰氏阳性菌抑制活性的组分,命名为TFAYDP2-2-1-1-2,液相色谱检测纯度为单一组分,质谱显示其分子量为2552.5Da,属于小分子抗菌肽,该组分对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑制浓度分别为10μg/mL和20μg/mL,对革兰氏阴性菌大肠杆菌、绿脓杆菌无活性。目前鞘翅目昆虫还未见如此低分子量的抗菌肽报道。 (5)喙尾琵甲抗菌肽的纯化:喙尾琵甲幼虫诱导组预纯化组分经一步反相色谱纯化,得到组分HWYDP1-1,对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。 综上所述,采用0.1%三氟乙酸作为黄粉虫幼虫抗菌肽的提取溶液,通过两步凝胶柱层析、一步反相色谱和一步高效液相色谱从黄粉虫幼虫抗菌肽粗提物中获得了一个纯化组分,具有较强的抑制金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌活性,对这两种革兰氏阳性菌的最小抑制浓度分别是10μg/mL和20μg/mL。但是该组分对革兰氏阴性菌大肠杆菌、绿脓杆菌无活性;质谱测定其分子量为2552.5Da,属于小分子量抗菌肽,目前鞘翅目昆虫体内未发现如此低分子量的抗菌肽。采用0.1%三氟乙酸溶液对喙尾琵甲幼虫抗菌肽进行了提取,通过两步凝胶柱层析、一步反相色谱从喙尾琵甲幼虫抗菌肽粗提物中获得一具有抑制金黄色葡萄球菌的组分。……   
[关键词]:黄粉虫;喙尾琵甲;抗菌肽;凝胶色谱;反相色谱;高效液相色谱
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国林业科学研究院2012年