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细菌诱导对离体昆虫细胞生长的影响和抗菌蛋白活性研究

宁超

  20世纪初感染性疾病曾经是全世界范围内导致死亡的主要原因[1]。抗生素的发现控制了传染性疾病的传播,同时也给人类带来抗药性问题。为了寻找抗生素的替代品,人们寻找了很多有可能的替代物。就目前研究状况,抗菌蛋白类是最有希望的成为下一代抗菌药物的候选物质之一。 本论文采用热灭活的藤黄微球菌诱导草地贪夜蛾细胞系Sf9和Sf21(为Sf9的克隆株)、麻蝇细胞系NIH-SaPe-4等3种离体培养的昆虫细胞,研究了诱导与非诱导条件下细胞生长状况、抗菌蛋白的出现时间、抗菌蛋白的稳定性、抗菌蛋白的分离纯化等。主要结果如下: (1)诱导对NIH-SaPe-4,Sf21和Sf9细胞生长的影响 灭活藤黄微球菌诱导的3种细胞相比于非诱导的细胞,恢复期细胞数量变化不大,但是恢复期时间延长;进入对数期的时间晚于非诱导组,对数期细胞增速小于非诱导组;进入稳定期的时间也比较晚,到达稳定期的时间夜晚于非诱导组;提前进入了衰亡期;培养细胞生命周期短于非诱导组。藤黄微球菌的加入使得3种细胞恢复期延长、对数期减缓、稳定期缩短,衰亡期提前,影响了细胞的生长。 (2)诱导对抗菌蛋白的影响 NIH-SaPe-4细胞在正常培养情况下能够产生抗菌蛋白,这种蛋白对3种革兰氏阳性菌(藤黄微球菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌)具有较强抑菌作用,对2种革兰氏阴性菌(大肠杆菌,绿色脓杆菌)无抑菌活性;灭活藤黄微球菌的加入使得原本产生的抗菌蛋白在产生时间上提前,在产生量上得到了加强。差异检验显示:诱导组和非诱导组的抗菌蛋白活性之间存在显著差异;灭活藤黄微球菌的诱导使得NIH-SaPe-4细胞产生抗菌蛋白的时间提前,活力得到了加强。 Sf21和Sf9细胞在正常培养情况下不能产生抗菌蛋白,但是经过灭活藤黄微球菌的诱导后,培养液中产生了抗菌蛋白;2种细胞产生抗菌肽的时间点都在6-12h之间。 (3)3种细胞抗菌蛋白的稳定性 pH在6-8范围内,藤黄微球菌诱导Sf21和Sf9细胞产生的抗菌肽活性变化不大;pH在5-7范围内,NIH-SaPe-4细胞产生的抗菌蛋白与非诱导组2者抑菌活性变化不大;但是3种细胞抗菌蛋白在pH小于3和pH大于11的极端环境下样品的活性会受到很大的影响,甚至消失。在温度方面,3种细胞抗菌蛋白沸水浴2h仍然保持较高活性。 3种细胞的抗菌蛋白具有一般抗菌肽和抗菌蛋白的共性,即酸碱相对稳定性和高温稳定性。 (4)抗菌蛋白的分离纯化 灭活藤黄微球菌诱导和非被诱导的NIH-SaPe-4细胞培养物过凝胶柱后均得到4个大致相同的峰,第3个峰均具有抑菌活性;活性峰过反相柱后均可得到3个峰,检测第2个峰均具有抑菌活性。 灭活藤黄微球菌经诱导的Sf21和Sf9细胞上清液过凝胶柱后均得到3个峰,第2个峰具有抑菌活性;第二个峰过反相柱后分别可得到6和7个峰,活性检测分别是第3和5个峰具有抑菌活性;诱导使得Sf21和Sf9细胞产生了抗菌肽。 (5)NIH-SaPe-4细胞抗菌蛋白的Tricine-SDS-PAGE 灭活藤黄微球菌诱导和非诱导的NIH-SaPe-4细胞培养物经过凝胶柱和反相柱分离纯化后,样品进行Tricine-SDS-PAGE。都得到一分子量约为60kDa抗菌蛋白,但经过藤黄微球菌诱导的条带比非诱导组的宽,比非诱导组的亮。藤黄微球菌的诱导使得这一60kDa的抗菌蛋白表达量得到了加强。……   
[关键词]:昆虫离体细胞系;抗菌蛋白;诱导;分离纯化;Tricine-SDS-PAGE
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国林业科学研究院2012年