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2010-2011年中国H3N8亚型EIV HA基因遗传演化分析及不同类型疫苗的初步研究

刘春国

  近年来H3N8亚型马流感(Equine influenza,EI)频繁暴发,免疫马也不能够完全抵抗新的流行毒株的攻击。目前我国仅在广州无规定马属动物疫病区使用OIE推荐的法国Merial公司生产的重组金丝雀痘病毒活载体疫苗Proteq-Flu1,而其疫苗株A/equine/Kentucky/1/1994(H3N8)(Ken94)与我国2007-2008年流行株的抗原性并不完全匹配。因此本论文主要研究我国EI病毒遗传演化规律,筛选出适合我国的疫苗株,同时利用反向遗传学技术制备EI灭活疫苗,并尝试EI重组腺病毒疫苗和病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗的研究工作,以期制备能够有效防控我国EI的候选疫苗。 2010-2011年间,在我国共分离到22株马流感病毒,对其中11株病毒的HA基因进行了克隆和遗传进化分析,结果表明中国2010-2011年分离株与2007-2008年分离株均属于佛罗里达2群中的亚洲亚群,但两者呈逐渐分离的趋势。当前使用的疫苗株Ken94则属于肯塔基谱系,与我国2010-2011年分离株之间在四处抗原位点发生8个氨基酸的变异。 在上述研究的基础上,利用反向遗传学技术将我国优势流行株A/Equine/Xingjiang/3/2007(H3N8)(XJ3)的HA和NA基因与PR8的内部基因进行重排,快速构建出重组疫苗株rH3N8-PR,该重组疫苗株具有低毒、稳定和鸡胚高产等优点。小鼠和豚鼠模型免疫实验表明该疫苗株保持了亲本株的抗原性,免疫后能够有效诱导小鼠产生血凝抑制(Hemagglutination inhibiting, HI)和病毒中和(Virus neutralizating, VN)抗体,能够对XJ3的攻击提供100%保护。马体实验结果表明含30μg HA蛋白的疫苗免疫后能够诱导所有马在短时间内产生HI和VN抗体,攻毒后虽然个别马体温有一过性升高的现象,但马匹不排毒,能够对XJ3的攻击提供100%的保护。而Proteq-Flu1仅能保护75%的马不排毒。 将XJ3HA基因插入到腺病毒载体中构建EI重组腺病毒活载体疫苗rAd-XJ3-HA。小鼠模型实验结果表明,重组腺病毒rAd-XJ3-HA具有良好的免疫活性,肌肉免疫能够诱导小鼠产生HI和VN抗体,并能够对XJ3的攻击提供100%保护,有效地清除病毒在小鼠体内的复制。马免疫实验果表明以108TCID50的疫苗能够诱导50%的马产生HI和VN抗体,另外50%的免疫马虽然没有产生可检测的HI抗体,但能够产生低水平的VN抗体。 利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统,成功构建重组XJ3HA和M1基因的杆状病毒rBV-XJ3-HA+M1,其感染昆虫细胞后表达的蛋白具有血凝活性,并能够形成VLPs。VLPs免疫小鼠后,能够有效诱导HI和NV抗体的产生,并能够对XJ3的攻击提供100%保护。 本研究发现我国马流感病毒发生了新的遗传和抗原变异情况,提示我们应该进一步加强我国EI的流行病学调查,并利用多种平台及系统开发研制安全有效的EI疫苗对我国马流感进行防控。利用反向遗传学技术拯救的EI疫苗株具有诸多优点,制备的灭活疫苗能够对马提供完全保护,是当前疫苗研究和应用的首选。初步研究显示EI重组腺病毒疫苗能够对马匹提供50%保护,有待进一步优化提高其免疫效果。EI VLPs疫苗在小鼠模型上展示了良好的免疫效果,下一步实验需要在马体上进行评价。 本研究的开展为我国EI疫苗的研究开辟了新的思路,填补了我国EI疫苗研究的空白。为研制符合我国国情、拥有我国自主知识产权的EI疫苗以及为我国EI的防控提供了理论基础和技术储备,具有重要的理论和实践意义。……   
[关键词]:H3N8亚型EI;HA基因遗传演化分析;反向遗传学技术;重组腺病毒疫苗;VLPs疫苗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2012年