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大团囊虫草菌发酵菌丝活性成分分析及抗肿瘤机制研究

孙一晟

  大团囊虫草菌属于线虫草科,寄生在树林下面的大团囊菌中,是我国稀贵的药用真菌,民间主要用于治疗血崩和月经不调。由于野生资源匮乏,野外采集大团囊虫草比较困难,近些年国内外对于大团囊虫草菌的研究并不是很多,缺少对其发酵菌丝系统的化学成分分析,也很少涉及其活性成分的作用机理。中国医药古籍的记载缺乏对大团囊虫草菌物质基础的清晰阐述,严重制约了大团囊虫草菌的深度开发。针对上述问题,本论文对珍贵的药用真菌大团囊虫草菌发酵菌丝进行了较为系统的化学成分分析,对其中活性化合物进行了初步的抗肿瘤活性筛选和抗肿瘤作用机制研究。 1.对大团囊虫草菌发酵菌丝进行了较系统的化学成分分析,结合现代波谱技术鉴定得到14个化合物,包括2个甾醇类、4个为倍半萜类、1个蒽醌类、4个多酚类、1个酚类和2个黄酮苷类化合物,其中13个化合物首次从大团囊虫草菌发酵菌丝中分离到。4个倍半萜类化合物是新化合物,分别被命名为大团囊虫草菌素A、B、C和D,已经提交了专利申请(201110111071.5),其中3个含有螺[4.5]癸烷骨架、属于菖蒲烷型倍半萜,另一个则是血管生成抑制剂5-demethoxyfumagillol的衍生物。2个黄酮苷类化合物均为含呋喃型五碳糖的苷类,从已知数据库的比对来看,很有可能是新的天然产物。同时我们又对大团囊虫草菌萃取物的部分油状组分进行了GC-MS分析,鉴定出了13种挥发性成分,包括1个酚类、1个烯类、1个甾醇酯类、3个长链不饱和脂肪酸类和7个长链不饱和脂肪酸酯类化合物。 2.体外抗肿瘤活性筛选发现新化合物3对HepG2、Hela和A549作用24 h后的IC50分别为36.2μg/ml、21.1μg/ml和40.2μg/ml,对于MCF-7没有明显杀伤作用,而化合物9对于HepG2、Hela、A549和MCF-7作用24 h后的IC50分别为39.45μg/ml、66.35μg/ml、37.9μg/ml和18.9μg/ml,且化合物3和9对于正常的人肝细胞L-02没有明显的生长抑制作用(IC50>80μg/ml)。同时,对多酚类化合物Daidzein(?)抑制肿瘤细胞MDA-MB-231转移进行了探索,并以层孔菌来源的多酚类化合物Hispolon为对照,结果表明Daidzein尽管具有抗肿瘤作用,但没有很强的抑制肿瘤细胞转移活性,而Hispolon可以通过减少细胞内金属基质蛋白酶-9(MMP-9)的转录和表达抑制MDA-MB-231细胞的转移。 3.对新化合物9 (Cordycepol C)抑制肝癌细胞HepG2生长的机制进行了初步研究。发现Cordycepol C(?)能诱导细胞染色质浓缩并形成凋亡小体、PARP-1蛋白剪切、核内基因组DNA断裂和细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,这些凋亡典型特征的出现表明Cordycepol C能诱导HepG2细胞发生凋亡,并且CordycepolC可以使HepG2细胞发生G2期阻滞。Cordycepol C不能激发HepG2(?)田胞内Caspases的活性及Caspases蛋白的剪切,而泛Caspases抑制剂Z-VAD-fmk也即不能抑制Cordycepol C对HepG2细胞的杀伤作用,也不能抑制Cordycepol C诱导细胞出现的凋亡特征,说明Cordycepol C诱导HepG2细胞发生Caspase非依赖性细胞凋亡。Western blot实验表明Cordycepol C可以诱导HepG2(?)田胞内促凋亡蛋白Bax表达量的上调,同时使Bax蛋白发生线粒体转移;细胞内线粒体膜电位的下降呈药物剂量依赖性和时间依赖性,线粒体内的促凋亡因子AIF和EndoG在用药6h后发生了核转移,而且线粒体膜电位在CordycepolC作用3h之后就发生了显著的下降。可见,Cordycepol C诱导细胞发生了线粒体途径介导的Caspase非依赖性细胞凋亡 上述研究初步揭示了大团囊虫草菌发酵菌丝的药效物质基础,首次报道了Cordycepol C诱导肝癌细胞发生线粒体途径介导的Caspase非依赖性凋亡机制,对大团囊虫草菌的药用资源深度开发进一步奠定了基础。……   
[关键词]:大团囊虫草;化学成分;倍半萜;Cordycepol C;Caspase非依赖性细胞凋亡
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2012年