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Bt工程菌HD8Ea2的构建及Cry8Ea2蛋白对华北大黑鳃金龟中肠微生物的影响

王伟

  华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)属于鞘翅目金龟甲总科(Scarabaeoidae),其幼虫对农、林、牧草等都有为害,在我分布广泛,种群数量大,危害严重。 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是革兰氏阳性细菌(G~+),在其生活史中能产生多种杀虫晶体蛋白,是目前应用最为广泛而有效的一种生物杀虫剂。本研究从全国各地的土样中筛选得到含cry8类基因的野生型菌株GW11,该菌株对华北大黑鳃金龟具有杀虫活性,LC_(50)为6.43×10~6cell/mL。Cry8Ea2蛋白是一种新型苏云金杆菌杀虫晶体蛋白。本研究通过穿梭载体pSXY422b将cry8Ea2导入Bt无晶体突变菌株HD73~-(cry~-)中,获得工程菌HD8Ea2。Cry8Ea2蛋白在工程菌中获得表达。通过分子筛层析,成功获得纯化的130kDa活性毒蛋白。用改进的生物活性测定方法进行Cry8Ea2蛋白对华北大黑鳃金龟一龄幼虫的杀虫活性测定,LC_(50)为0.2679μg/mL。 本研究应用16S rDNA PCR-RFLP方法,对正常生长的华北大黑鳃金龟二龄幼虫和饲喂Cry8Ea2蛋白的二龄幼虫中肠微生物进行了研究。从正常生长和饲喂Cry8Ea2蛋白的二龄幼虫中分别得到300个含有16S rDNA的克隆,分别随机挑选24个克隆进行PCR-RFLP的鉴定,结果发现:源自正常二龄幼虫的的24个克隆呈现17种不同带型;源自饲喂Cry8Ea2蛋白的二龄幼虫的24个阳性克隆呈现5种不同带型。……   
[关键词]:苏云金杆菌;华北大黑鳃金龟;CryEa2蛋白;Bt工程菌;生物活性测定;中肠微生物;16S rDNA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2012年