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Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀羟基化的研究

曹艳辉

  无锡他汀是一种新型的羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,是一种潜在的高效降血脂药物。无锡他汀是由洛伐他汀经Amycolatopsis sp.ST2710转化生成,羟基化反应是这一转化过程中的关键限速反应。本文运用蛋白质组学技术对底物诱导前后菌体蛋白差异点进行了分析和鉴定,研究了全细胞提取液羟基化酶的催化特性,并对固定化细胞分段转化无锡他汀的工艺进行了探索。 首次运用蛋白质组学2-DE技术对羟基化反应过程中的关键蛋白进行了研究。将经蛋白裂解液提取得到的菌体总蛋白纯化,选择pH 4~7的IPG胶条和合适的等电聚焦程序进行等电聚焦,可以很好的实现蛋白点的分离。用PDQuest 8.0.1软件分析底物诱导前后的双向电泳图谱,发现经过洛伐他汀诱导后,出现了5个差异蛋白点,通过MOLDI-TOF-MS鉴定和数据库比对,确定3个已知功能的蛋白:Fe调节外膜蛋白、Fe-S氧化还原蛋白和GTP结合蛋白YchF,三个蛋白与菌体的羟基化反应均有关,在羟基化过程中主要起调控作用。 对全细胞抽提液羟基化酶的酶催化特性进行了考察。结果表明:酶促适宜温度为37~55℃,适宜pH为7.3~8.3;羟基化酶严格依赖NADH作为电子供体,且NADH与NADPH对羟基化反应没有协同增效作用;Fe2+、Fe3+、Co2+对羟基化反应有促进作用,Cu2+、Zn2+、Ba2+有抑制作用,细胞色素c对羟基化反应有强烈的抑制作用;羟基化酶的表观Km为163.76μM,Vmax为9.50μM/min。 以中间产物Ⅰ对洛伐他汀的转化率为指标,对Amycolatopsis sp.ST2710细胞固定化工艺进行了研究。采用单因素和Box-Behnken优化实验,获得了细胞固定化的最佳工艺条件:海藻酸钠浓度19.0 g/L、包埋菌体量2.1 mL菌悬液/10.0 mL凝胶、固定化细胞量3.5 mL胶珠/10.0 mL转化培养基、CaCl2浓度10.0 g/L、固定化时间1 h。 在上述优化结果的基础上,采用固定化细胞分段转化无锡他汀并对转化工艺条件进行了优化。最终确定了转化两阶段pH分别为7.5和5.5、转化时间分别为48 h和10 h、洛伐他汀添加量为3.0 g/L、转化培养基中淀粉浓度为15.0 g/L。在上述转化条件下,中间产物Ⅰ对洛伐他汀的转化率为65.4%,无锡他汀对中间产物Ⅰ的转化率为75.0%。该工艺将菌体对底物洛伐他汀的耐受浓度从1.0 g/L提高到3.0 g/L,将转化培养基中的淀粉浓度从40.0 g/L降低至15.0 g/L,同时将转化周期缩短了5 h,且固定化细胞可以连续转化5批。……   
[关键词]:洛伐他汀;无锡他汀;Amycolatopsis sp.ST2710;蛋白质组学技术;羟基化酶;固定化细胞;分段转化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2012年
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