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L-缬氨酸代谢工程育种的研究

侯小虎

  本文根据代谢工程育种的基本原理,首先对L-缬氨酸生物合成进行了调节,构建了能够有效提高L-缬氨酸产量的质粒pDXW-8-ilvEBNrC;随后对L-缬氨酸前体物质供给进行了调节并对副产物生成进行了最少化,成功解决了L-缬氨酸发酵副产物特别是L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸的问题。主要研究内容和结论如下: L-缬氨酸生物合成的调节:以B. flavum ATCC14067为宿主,运用穿梭表达载体pDXW-8(tac;KmR)过表达不同的ilv基因,过表达来源于B. flavum NV128解除了三种支链氨基酸对AHAS反馈抑制的ilvEBNrC获得了最高L-缬氨酸产量。在传统31°C 72 h发酵中,L-缬氨酸产量达到了30.08±0.92 g/L,但是糖酸转化率较低为0.129 g/g。为了进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率,基于L-缬氨酸生物合成酶的最适温度(高于35°C)和黄色短杆菌的耐热性,发酵温度分别提高到34°C, 37°C, 40°C。高温发酵获得了较高的代谢速率和L-缬氨酸生物合成酶活性,37°C 48 h发酵获得最高L-缬氨酸产量38.08±1.32 g/L、糖酸转化率0.241 g/g、比产酸速率0.133 g/g/h。pDXW-8-ilvEBNrC是提高L-缬氨酸产量的有效工具;在耐热菌株中表达L-缬氨酸生物合成关键酶基因来提高L-缬氨酸产量的策略或许对提高支链氨基酸产量提供了新颖的方法。 L-缬氨酸前体物质供给的调节以及副产物生成的最少化:以C.glutamicum ATCC13032和B. flavum JV16(L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸缺陷)为出发菌株,过表达ilvEBNrC进行31°C 72 h发酵。为了减少L-缬氨酸发酵中副产物的积累以及进一步提高L-缬氨酸生物合成前体物质的供给,采取了不同的策略:ilvA的自身启动子被弱启动子MPilvA (P-ilvAM1CG)替换,以达到降低L-异亮氨酸生物合成的速率的目的;研究不同溶氧对C. glutamicum ATCC13032 MPilvA pDXW-8-ilvEBNrC和B. flavum JV16 pDXW-8-ilvEBNrC产酸和副产物生成的影响,表明15 %的饱和度(最少L-乳酸和L-谷氨酸积累)或许是L-缬氨酸生物发酵的最适相对溶氧;为了移除发酵中的副产物L-丙氨酸,分别对C.glutamicum和B.flavum的alaT和/或avtA基因进行失活,与过表达ilvEBNrC的菌株较高L-丙氨酸的积累相比, C. glutamicum ATCC13032MPilvA△avtA pDXW-8-ilvEBNrC可以产生31.15±1.032 g/L L-缬氨酸且仅有0.18±0.002 g/L L-丙氨酸积累,同时, B. flavum JV16avtA::Cm pDXW-8-ilvEBNrC可以产生38.82±1.974 g/L L-缬氨酸且仅有0.22±0.002 g/L L-丙氨酸积累。结果表明:通过过表达ilvEBNrC基因使L-缬氨酸生物合成增强时,应当破坏avtA基因以达到L-丙氨酸最少积累。本研究提供了一种结合多种策略最少化副产物提高L-缬氨酸产量的方法。……   
[关键词]:黄色短杆菌;谷氨酸棒杆菌;L-缬氨酸;ilvEBNrC;alaT;avtA;高温发酵
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2012年