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霍乱弧菌外膜蛋白W和U的克隆表达及抗原性研究

李建华

  霍乱弧菌(vibrio cholerae)属于弧菌属,革兰氏阴性菌,是人类烈性肠道传染病霍乱的病原菌,若不及时救治死亡率高达50%以上。据报道全球每年由O1群和O139群引起200万霍乱病例,以亚洲、非洲和拉丁美洲流行较为严重,非O1和O139群是引起我国部分地区腹泻爆发流行的主要病原菌,因此检测霍乱弧菌是有效控制和防治该病的关键。 霍乱弧菌检测方法很多,如分离培养法、血清学方法和PCR法等,但各有其无法避免的缺点而限制了推广使用。胶体金免疫标记技术是以胶体金为标记物,具有快速简便、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点,已广泛应用于医学、动植物检疫、食品安全监督等各领域。霍乱弧菌胶体金免疫层析检测试纸条国内外已有上市产品,但多采用霍乱弧菌多糖抗原制备检测用抗体,致使特异性减低或生产成本过高而不利于推广。 外膜蛋白W(OmpW)和外膜蛋白U(OmpU)在霍乱弧菌的不同血清群中都存在,具有较好抗原性,机体感染霍乱弧菌后可产生OmpW和OmpU的特异性抗体。OmpW和OmpU是霍乱弧菌的潜在粘附因子,在细菌侵袭肠道过程中起一定作用,可能与细菌侵袭性和毒力有关。OmpW作为一种遗传保守、种特异性抗原,在霍乱弧菌不同血清群中均低水平表达,可以作为霍乱弧菌检测的候选靶点。OmpU是一种孔通道蛋白,功能与大肠杆菌外膜蛋白F(OmpF)相似,但核苷酸序列不具有同源性。OmpU占外膜蛋白总量的30%左右,含盐环境中可达到60%。本研究为国家传染病重大专项资助课题,利用基因工程技术获得霍乱弧菌重组蛋白OmpW和OmpU(r-OmpW和r-OmpU),制备多克隆抗体,期望该抗体能够用于霍乱弧菌的快速检测。研究内容和结果主要包括以下三个部分: 一、库存霍乱弧菌的鉴定 为保证研究所用的模板和检测靶标具有准确性,我们首先对库存的弧菌进行了系统鉴定。本实验首先将31株霍乱弧菌弧菌分别接种碱性蛋白胨水复苏培养6-8h后,吸取少量菌液接种胰酶大豆琼脂培养基培养12h,菌落呈圆形凸起、表面光滑、边缘整齐,革兰氏染色呈阴性,显微镜下观察可见菌体短小,稍弯曲呈弧状或逗点状,暗视野下呈流星样或穿梭状运动。在形态学鉴定基础上,应用API 20NE系统将31株弧菌进行生化鉴定,结果显示27株属于霍乱弧菌,而另外4株为其它弧菌。根据霍乱弧菌种特异性抗原ompW基因设计特异性引物,从基因水平鉴定霍乱弧菌,与API 20NE鉴定结果一致,显示机检的准确率高于手检。为确定霍乱弧菌的血清群及血清型,应用O1群多价诊断血清、O1群小川型诊断血清、O1群稻叶型诊断血清和O139群诊断血清进行血清学鉴定,结果此次鉴定的27株霍乱弧菌中,860064菌株、860065菌株、860066菌株、860067菌株、860068菌株、860069菌株、86006-10菌株和860120菌株属于O1群小川型;860071菌株、860072菌株、860075菌株、860077菌株、860081菌株、860082菌株、860083菌株、860101菌株、860112菌株、860118菌株和860121菌株属于O1群稻叶型;860091菌株、860106菌株和860111菌株属于O1群彦岛型;病人1菌株、环境2菌株和环境3菌株属于O139群;17015菌株和17018菌株属于非O1和O139群。 二、霍乱弧菌OmpW和OmpU的原核表达及抗原性分析 根据NCBI网站公布的霍乱弧菌ompW和ompU基因序列设计引物,以霍乱弧菌860069株基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(polymerse chain reaction, PCR)扩增得到除信号肽外的ompW核心序列和ompU基因序列。经1%琼脂糖凝胶电泳分析,PCR扩增产物片段大小约为588bp和1026bp,与预期大小一致。将目的片段与克隆载体pMD18-T连接,分别构建了重组质粒pMD18-T-ompW和pMD18-T-ompU,转化至JM109感受态细胞,获得含有目的基因序列的克隆菌株。该菌株经PCR鉴定后,提取阳性重组克隆质粒,经限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切后回收目的条带,将其与相同双酶切后的表达载体pET32a连接,构建重组表达质粒pET32a-ompW和pET32a-ompU,转化至BL21(DE3)感受态细胞。经PCR和双酶切鉴定,阳性菌株经测序后,利用NCBI BLAST序列比对分析相似性均为99%,开放读码框正确,保证了r-OmpW和r-OmpU一级结构的准确性。由于融合了硫氧还蛋白,得到的r-OmpW和r-OmpU的分子量分别为41kDa和57kDa。SDS-PAGE分析显示r-OmpW和r-OmpU在37℃诱导5h时表达量最大,约占全部菌体蛋白的53%和57%。将诱导菌体超生破碎,发现r-OmpW和r-OmpU均以包涵体形式高效表达。经尿素变性及梯度透析复性纯化后,纯度均在90%以上。Western Blot结果表明:r-OmpW和r-OmpU能和霍乱弧菌免疫兔血清反应,具有较好抗原性。 纯化的r-OmpW和r-OmpU蛋白按常规方法免疫新西兰大耳白兔,双向琼脂糖检测抗体效价可达1:32。Western Blot结果显示OmpW和OmpU多克隆抗体均能与O1群古典型和EL Tor型、O139群霍乱弧菌特异性结合,可进一步用于检测霍乱弧菌。 三、霍乱弧菌rOmpW和rOmpU抗体在胶体金免疫层析检测中的初步应用 本研究利用柠檬酸三钠还原法制备直径约为25-30nm的胶体金颗粒,分别标记rOmpW和rOmpU抗体,优化标记条件,确定稳定胶体金最适抗体浓度为30μg/ml,最佳标记pH值为9.0,得到的金标探针在520nm处的A值分别为3.51和4.05,在适宜的A值(2.5~10)范围内,符合设计要求。应用rOmpW和rOmpU抗体包被硝酸纤维素膜的最适浓度均为4mg/ml。 霍乱弧菌rOmpW和rOmpU抗体在胶体金免疫层析的初步应用结果显示:2种抗体对27株霍乱弧菌检测均为阳性,最低检测浓度均为均为1.8×10~8cfu/ml。结果还显示2种抗体胶体金试纸条均发生交叉反应,其中,rOmpW抗体的试纸条与副溶血性弧菌860160菌株发生交叉反应,rOmpU抗体的试纸条与创伤弧菌870101菌株和副溶血性弧菌860160菌株发生交叉反应,可能与弧菌属部分菌株的氨基酸序列之间具有同源性有关,有待于进一步研究验证。……   
[关键词]:霍乱弧菌;外膜蛋白;W和U;抗原性;胶体金免疫层析法
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2011年