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Streptomyces sp.M-Z18发酵生产ε-聚赖氨酸的碳源供给策略与过程调控研究

陈旭升

  ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是微生物通过非核糖体合成方式催化25~35个L-赖氨酸单体,以α-COOH和ε-NH_2相互缩合的方式而形成的一种同型L-赖氨酸链状聚合物,分子量一般为2500~4500 Da。由于其具有抑菌性广、水溶性强、热稳定性好、pH值使用范围广以及安全性高等优点,目前主要作为食品防腐剂应用在食品防腐和保鲜领域,已经在日本形成数十亿日元市场。同时,作为一种阳离子型生物聚合物,ε-PL还广泛应用于生物材料和药物载体研究。因此,研究开发ε-PL发酵技术以提高ε-PL发酵水平,实现低成本、高效率ε-PL发酵生产,为我国建立ε-PL产业提供技术支撑。 本论文利用一株ε-PL高产菌Streptomyces sp. M-Z18,提出了工业甘油、甘油和葡萄糖混合物、前体L-赖氨酸作为发酵底物的供给策略,通过发酵过程优化与调控技术,显著提高了ε-PL发酵水平;考察了甘油和葡萄糖作碳源引起ε-PL合成的差异;研究了Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-PL的机制;建立了转化前体L-赖氨酸耦合发酵生产ε-PL的工艺。具体研究内容如下: (1)在确定工业甘油作为发酵碳源的前提下,筛选出相匹配的牛肉浸膏、(NH4)2SO_4、KH_2PO_4、K_2HPO_4、MgSO_4·7H_2O和FeSO_4·7H_2O作为Streptomyces sp. M-Z18合成ε-PL的营养成分;借助Plackett-Burman设计确定了甘油、硫酸铵和K_2HPO_4是影响ε-PL合成的关键营养成分;利用响应面分析构建出最优营养组合为:甘油60 g/L,(NH4)2SO_4 5 g/L,牛肉浸膏10 g/L,KH_2PO_4 4 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.8 g/L,FeSO_4·7H_2O 0.05 g/L。利用该优化培养基自然发酵生产ε-PL(pH值不控制),摇瓶ε-PL产量达到2.27 g/L,菌体干重达到7.75 g/L;5 L发酵罐分批发酵ε-PL产量为3.5 g/L,是出发培养基(M3G培养基)的3倍。 (2)在研究pH值对ε-PL发酵过程影响的基础上,以最大ε-PL比合成速率为调控目标,建立了一种利用甘油为碳源的两阶段pH值控制策略发酵生产ε-PL工艺。该工艺使得ε-PL分批发酵产量和产率达到9.13 g/L和4.76 g/L/d,较最优单一pH值控制发酵(pH3.5)分别提高16.6%和52.1%。结合甘油和硫酸铵流加技术,ε-PL发酵产量达到30.11 g/L,ε-PL产率为4.18 g/L/d,转化率达到13.2%。根据葡萄糖和甘油发酵生产ε-PL的互补性优点,提出了甘油-葡萄糖双碳源发酵生产ε-PL工艺。研究发现,Streptomyces sp. M-Z18不仅能够同步消耗甘油和葡萄糖用于菌体生长和ε-PL合成,并且显著缩短了发酵时间,提高了ε-PL合成速率。当葡萄糖和甘油混合比例为30/30(w/w)时,发酵速率比任何单一碳源都显著提高:较葡萄糖快25.4%,较甘油快32.8%。甘油-葡萄糖双碳源(30/30,w/w)补料-分批发酵使得ε-PL发酵产量达到35.14 g/L,ε-PL产率为4.85 g/L/d,转化率为12.1%。 (3)在考察甘油和葡萄糖对Streptomyces sp. M-Z18合成ε-PL影响时,发现甘油和葡萄糖引起了ε-PL合成的显著差异。通过对两种碳源下ε-PL发酵过程关键酶活性变化考察,发现磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)在以葡萄糖为碳源的发酵过程中表现出较高活性,而天门冬氨酸激酶(ASPK)和ε-PL合成酶(Pls)在以甘油为碳源的发酵过程中活性较高;两种碳源下ε-PL发酵过程代谢通量分析表明:以甘油为碳源减小了杂氨基酸合成和菌体合成通量,增大了磷酸戊糖途径、TCA循环回补途径、天门冬氨酸族氨基酸合成途径和L-赖氨酸合成等途径的代谢流量,而TCA循环代谢通量基本保持不变,这说明甘油作碳源能够使得更多的碳代谢流流向ε-PL的合成途径,减少了代谢副产物的生成,提高了产物转化率;考察不同还原度碳源(葡萄糖酸、葡萄糖和山梨醇)对菌体生长和ε-PL合成影响,发现碳源还原度越接近前体L-赖氨酸还原度越有利于ε-PL合成。在上述实验结论的基础上,提出了甘油优于葡萄糖合成ε-PL的可能机制在于:①甘油作为小分子多元醇通过水取代机理稳定了酶的空间构象而提高了ε-PL合成途径中天门冬氨酸激酶和ε-PL合成酶活性,从而增大了ε-PL合成途径代谢通量,提高了ε-PL产量;②甘油与L-赖氨酸还原度相同,实现了底物和产物前体的氧化还原平衡,减少了代谢副产物生成,提高了产物转化率;③甘油比葡萄糖为ε-PL合成提供了更多的能量辅因子ATP。 (4)利用两阶段培养方法考察前体L-赖氨酸对ε-PL合成影响时,发现低浓度(1~2 g/L)L-赖氨酸能够显著促进ε-PL合成。利用同位素标记方法(L-(U-13C)赖氨酸)和核磁共振分析技术(NMR)研究L-赖氨酸转化机制时,发现L-赖氨酸是作为整体直接参与ε-PL合成,且细胞转化前体L-赖氨酸比例为40%左右,该比例不会随着前体L-赖氨酸浓度的增加而提高。在对甘油、pH值、L-赖氨酸和细胞膜通透性等因素的考察基础上,建立了Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-PL体系并强化了该转化过程。通过对转化过程的研究,发现转化体系合成ε-PL来源于两条途径:①转化外源L-赖氨酸合成ε-PL途径;②转化甘油形成内源L-赖氨酸合成ε-PL途径。 (5)在考察pH值对5 L发酵罐规模Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-PL过程影响的基础上,建立了5 L发酵罐规模补料-分批转化体系,使得ε-PL合成能力达到15 g/L。前体L-赖氨酸添加方式对ε-PL发酵过程影响研究结果表明,在发酵后期添加1 g/L L-赖氨酸有利于实现发酵与前体L-赖氨酸转化的同步进行。结合甘油单一碳源和甘油-葡萄糖双碳源发酵生产ε-PL工艺,初步建立转化前体L-赖氨酸耦合发酵生产ε-PL工艺。两种ε-PL生产工艺分别实现ε-PL发酵产量达到33.76 g/L和37.6 g/L。……   
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